Enhancement of tomato resistance to Tuta absoluta by the expression of two barley proteinase inhibitors

Evolution has provided vast genetic diversity, enabling plants to surmount many biotic pressures. Plants have evolved various morphological and biochemical adaptations to cope with herbivores attacks. Despite that, yearly, around 40 % of worldwide crop production is lost due to pests and pathogens, with 13 % due to insects. Tuta absoluta has become a major pest threatening tomato crops worldwide and without the appropriated management it can cause production losses between 80 to 100 %. To cope with this threat, we need to strengthen plant defense arsenals. The incorporation to plants of defensive genes like proteinase inhibitors by means of genetic engineering is a promising alternative. In the first chapter of this work we investigated the inhibitory activity of two trypsin inhibitors from barley; BTI-CMe and BTI-CMc. Besides, we succeeded to increase the BTI-CMc in vitro inhibitory activity by introducing a single mutation in its putative reactive site. In the second chapter, we investigated the in vivo effect of (a serine proteinase inhibitor) BTI-CMe and a (cysteine proteinase inhibitor) Hv-CPI2 isolated from barley on Tuta absoluta and we examined the effect of their expression on the tomato defensive response. We found that larvae fed on the double transgenic plants showed a notable reduction in weight. Moreover, only 56% of the larvae reached the adult stage. The emerged adults showed wings deformities and reduced fertility. We also investigated the effect of proteinase inhibitors ingestion on the insect digestive enzymes. Our results showed a decrease in larval trypsin activity. Proteinase inhibitors had no harmful effect on Nesidiocoris tenuis; a predator of Tuta absoluta, despite transgenic tomato plants attracted the mirid. We investigated whether or not plant defensive mechanisms were activated in the transgenic tomato plants and found that, interestingly, the expression of the barley cysteine proteinase inhibitor promoted plant defense, inducing the tomato endogenous wound inducible proteinase inhibitor 2 (Pin2) gene. Moreover, glandular trichomes production was increased and the emission of volatile organic compounds was altered. Our results demonstrate the usefulness of the co-expression of different proteinase inhibitors for the enhancement of plant resistance to pests.La evolución ha proporcionado una gran diversidad genética, permitiendo a las plantas superar muchas presiones bióticas. Las plantas han desarrollado diversas adaptaciones morfológicas y bioquímicas para hacer frente a los ataques de los herbívoros. A pesar de ello, anualmente, alrededor del 40 % de la producción mundial de cultivos se pierde debido a plagas y patógenos, siendo un 13 % debido a insectos. Tuta absoluta se ha convertido en una de las principales plagas que amenazan los cultivos de tomate en todo el mundo y sin la gestión adecuada puede causar pérdidas de producción entre el 80 y el 100 %. Para hacer frente a esta amenaza, necesitamos fortalecer los arsenales de defensa de las plantas. La incorporación a las plantas, mediante ingeniería genética, de genes defensivos como los inhibidores de proteinasas es una alternativa prometedora. En el primer capítulo de este trabajo se investigó la actividad inhibitoria de dos inhibidores de tripsina procedentes de cebada; BTI-CMe y BTI-CMc. Además, se logró aumentar la actividad inhibitoria in vitro de BTI-CMc mediante la introducción de una única mutación en su putativo centro reactivo. En el segundo capítulo, se investigó el efecto in vivo de un inhibidor de serin proteinasa (BTI-CMe) y un inhibidor de cisteín proteinasa (Hv-CPI2) aislado de cebada en Tuta absoluta y se examinó el efecto de su expresión en la respuesta defensiva del tomate. Se encontró que las larvas alimentadas con las plantas transgénicas dobles mostraron una notable reducción de peso. Además, sólo el 56 % de las larvas alcanzó la etapa adulta. Los adultos emergentes mostraron deformidades de las alas y reducción de la fertilidad. También se investigó el efecto de la ingesta de inhibidores de proteinasa en las enzimas digestivas de los insectos. Nuestros resultados mostraron una disminución en la actividad tripsina larvaria. Los inhibidores de proteinasas no tuvieron efectos nocivos sobre Nesidiocoris tenuis(depredador de Tuta absoluta) a pesar de que las plantas transgénicas de tomate atrajeron al mirido. Se investigó si los mecanismos defensivos de las plantas se activaban en las plantas de tomate transgénico y se encontró que, curiosamente, la expresión de la cistatina de cebada promovía la defensa de la planta, induciendo el gen del inhibidor de proteasa 2 endógeno del tomate, inducible por herida (Pin2). Además, aumentó la producción de tricomas glandulares y se alteró la emisión de compuestos orgánicos volátiles. Nuestros resultados demuestran la utilidad de la co-expresión de diferentes inhibidores de proteinasas para el aumento de la resistencia de las plantas a plagas.L'evolució ha proporcionat una gran diversitat genètica, permetent a les plantes superar moltes pressions biòtiques. Les plantes han desenvolupat diverses adaptacions morfològiques i bioquímiques per fer front als atacs dels herbívors. Tot i això, anualment, al voltant del 40 % de la producció mundial de cultius es perd a causa de plagues i patògens, amb un 13 % a causa de insectes. Tuta absoluta s'ha convertit en una de les principals plagues que amenacen els cultius de tomaca a tot el món i sense la gestió adequada pot causar pèrdues de producció entre el 80 i el 100 %. Per fer front a aquesta amenaça, necessitem enfortir els arsenals de defensa de les plantes. La incorporació a les plantes de gens defensius com els inhibidors de proteïnases per mitjà de l'enginyeria genètica és una alternativa prometedora. En el primer capítol d'aquest treball es va investigar l'activitat inhibitòria de dos inhibidors de tripsina aïllats a partir d'ordi; BTI-CMe i BTI-CMC. A més, es va aconseguir augmentar l'activitat inhibitòria in vitro de BTI-CMC mitjançant la introducció d'una única mutació en el seu lloc reactiu putatiu. En el segon capítol, es va investigar l'efecte in vivo d'un inhibidor de serin proteinasa (BTI-CMe) i un inhibidor de cisteïn proteinasa (Hv-CPI2) aïllats d'ordi en Tuta absoluta i es va examinar l'efecte de la seva expressió en la resposta defensiva del tomaca. Es va trobar que les larves alimentades amb les plantes transgèniques dobles van mostrar una notable reducció de pes. A més, només el 56 % de les larves va aconseguir l'etapa adulta. Els adults emergents van mostrar deformitats de les ales i reducció de la fertilitat. També es va investigar l'efecte de la ingesta d'inhibidors de proteinasa en els enzims digestius dels insectes. Els nostres resultats van mostrar una disminució en l'activitat tripsina larvària. Els inhibidors de proteïnases no van tenir efectes nocius sobre Nesidiocoris tenuis, un depredador de Tuta absoluta, tot i les plantes transgèniques de tomaca van atreure al mirid. Es va investigar si els mecanismes defensius de les plantes s'activaven a les plantes de tomaca transgènic i es va trobar que, curiosament, l'expressió de cistatina d'ordi promovia la defensa de la planta, induint el gen de l'inhibidor de proteasa 2 endogen de la tomaca, induïble per ferida (Pin2). A més, va augmentar la producció de tricomes glandulars i es va alterar l'emissió de compostos orgànics volàtils. Els nostres resultats demostren la utilitat de la co-expressió de diferents inhibidors de proteïnases per a l'augment de la resistència de les plantes a plagues.Hamza, R. (2017). Enhancement of tomato resistance to Tuta absoluta by the expression of two barley proteinase inhibitors [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9272