Studio del rilascio di ATP da parte di emicanali di Cx32 mediante biosensori basati su Förster Resonance Energy Transfer

La seconda forma più diffusa della neuropatia di Charcot-Marie-Tooth è la CMTX1. Tale malattia si manifesta con amiotrofia e debolezza muscolare, anomalie sensoriali in particolare alle estremità degli arti, causando difficoltà di deambulazione e dolore che richiedono ausili protesici e farmacologici. Essa è causata da mutazioni genetiche della proteina connessina 32 (Cx32). La Cx32 forma canali di giunzione nella guaina mielinica delle cellule di Schwann ed è stato recentemente ipotizzato che tali canali siano implicati nel processo di mielizzazione mediante il rilascio di adenosina trifosfato (ATP). L’ATP, oltre a svolgere la funzione di mediazione chimica nel metabolismo energetico, è un neurotrasmettitore del sistema nervoso autonomo e funge dunque da messaggero extracellulare. Un'alterazione della segnalazione paracrina, dovuta alla disfunzione degli emicanali di Cx32, potrebbe essere alla base della patogenesi del CMTX1. Il lavoro di tesi si pone l’obiettivo di completare la caratterizzazione della sonda ecAT3.10, un biosensore dell’ATP basato su tecnica FRET (Förster Resonance Energy Transfer) allo scopo di utilizzarlo per misure di rilascio di ATP da parte di emicanali di Cx32, sia sani che con mutazioni CMT1X, espressi in cellule modello HeLa. I risultati sono stati molto positivi per quanto riguarda il completamento della curva dose-risposta di ecAT3.10 che si dimostra in grado di rilevare concentrazioni di ATP estremamente basse, fino a 10 nM. Incoraggianti anche se contraddittori sono stati i test di misura del rilascio di ATP da parte degli emicanali di Cx32 sani. Il segnale di ecAT3.10 dovuto all’eventuale rilascio di ATP appare sovrapporsi ad un secondo segnale di maggior ampiezza attivato dal tipo di stimolazione cellulare usata (istamina). Ulteriori esperimenti saranno quindi necessari per identificare ed escludere tale segnale contaminante