Impact of OST catalytic isoforms STT3A and STT3B on global glycosylation and ER homeostasis

Der Glycosylierungs-Mechanismus in Eukayoten wurde in der Vergangenheit intensiv erforscht. Anhand von strukturellen Daten über den Oligosaccharyltransferase Komplex und dessen Zusammensetzung, sowie über biochemische Assays zur Studie der Glycosylierung, wurden zwei verschiedene katalytische Untereinheiten entdeckt. Die STT3A Untereinheit wird als co-translational beschrieben, während STT3B post-translational glycosyliert, wenn bestimmte Stellen am Protein von STT3A ausgelassen werden. Proteomische Studien, die das Glycosylierungsverhalten der beiden Untereinheiten während des Knockouts der jeweils anderen beschreiben, fehlen jedoch. Für ein Knockout Modell in mESCs für STT3A and STT3B wurde ein Glycoproteomischer Workflow entwickelt, um intakte Glycopeptide quantitativ zu messen. Eine hpH Chromatographie wurde verwendet um Identifikation durch optimale Separation von Peptiden zu erhöhen. Als Anreicherungsmethode für Glycopeptide wurde ein HILIC System verwendet. Die Datenanalyse wurde mit der SugarQb Software durchgeführt, welche die Identifikation von intakten Glycopeptiden erlaubt. Die zahlreichen Spezifikationen die für STT3B in früheren Studien gefunden wurden, konnten in diesem Modell nicht nachgewiesen werden. Allerdings konnte eine Änderung auf Glycosylierungsebene sehrwohl festgestellt werden. Der Knockout beider Untereinheiten produzierte Zellen mit normaler Überlebensrate und die Glycosylierung konnte durch Kompensation der jeweils anderen Untereinheit aufrechterhalten werden. Insbesondere ER-resident Proteine und jene des ERAD, wiesen Abhängigkeiten für beide katalytischen Untereinheiten des OST Komplexes auf. Die hohe Aktivität von STT3B im STT3A Knockout zeigt, dass STT3B dazu in der Lage ist, mehr als nur bestimmte Positionen im Protein zu glycosylieren, die von STT3A übersprungen werden.Eukaryotic glycosylation machinery has been extensively studied in the past. Combining structural information on the complex assembly and using biochemical assays to follow glycosylation behavior of the OST targets have led to the identification of two distinct catalytic subunits. STT3A has been found to act co-translationally and to be responsible for most glycosylation events in the cell. STT3B, however, should post-translationally glycosylate skipped sites or sequons, that are not easily accessible. However, proteomics studies, that cover the general glycosylation development upon depletion of either one of the two catalytic subunits, are still missing. On a mouse embryonic stem cell knockout model for both STT3A and STT3B, a comparative and quantitative glycoproteomics workflow was developed to cover the glycosylation response at intact glycopeptide level. This approach involves a hpH-chromatographic separation of peptides and a HILIC separation for glycopeptide enrichment. Data analysis of intact glycopeptides was performed with the SugarQb software. STT3B dependencies of proposed sites could not be determined with this approach using this mESC model. Still, a response in glycosylation could be observed at protein level. Both knockout models where viable and capable of maintaining glycosylation levels by compensating it due to increase in the each other subunit. Although certain proteins, such as many ER residential proteins of the ERAD machinery, show a dependency of certain glycosylation subunits, STT3B is still able to outcome its role as attendant modifier