Chloroplast biogenesis : Alternative targeting pathways

Le chloroplaste est un composant majeur de la cellule végétale. Cet organite est le fruit d’une endosymbiose, survenue entre une cellule eucaryote et une cyanobactérie. Ainsi, 95% des gènes codant pour les protéines plastidiales ont été transférés vers le génome nucléaire au cours de l’évolution. En conséquence, la plupart des protéines chloroplastiques sont aujourd’hui codées par le noyau, synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseurs dotés d’une une extension N-terminale clivable (le "peptide de transit") et ensuite importées sans les chloroplastes via le système TOC/TIC (Translocons localisés au niveau des membranes externe et interne de l'enveloppe des chloroplastes). Jusqu'à récemment, toutes les protéines destinées aux compartiments chloroplastiques internes étaient censées posséder une séquence d’adressage N-terminale clivable et engager la machinerie d’import général TOC/TIC. Cependant, des études récentes reposant sur des approches protéomiques ont révélé l’existence de plusieurs protéines chloroplastiques dépourvues de la séquence additionnelle clivable. La première évidence de telles protéines dites non canoniques a été fournie par notre équipe, étudiant le protéome de l’enveloppe du chloroplaste d’Arabidopsis, qui a conduit à l’identification d’une protéine quinone oxidoréductase homologue nommée « ceQORH ». Bien que dépourvues de peptide de transit clivable, il s’est avéré que ces protéines sont capables de rejoindre les compartiments chloroplastiques internes. D’autre part, il a été également montré que l’import de ces protéines dans le chloroplaste n’est pas médiée par la machinerie de translocation générale TOC/TIC. De plus, il s’est avéré que ces protéines ont la particularité d’être multilocalisées dans les cellules de différents tissus de la feuille. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la localisation sub-cellulaire de telles protéines chloroplastiques non canoniques demeurent encore inconnus. Pour mieux caractériser fonctionnellement les composantes des systèmes d’import alternatifs de protéines chloroplastiques non canoniques, nous avons adopté une approche directe qui reposait sur des techniques biochimiques combinant le crosslink chimique, la purification par affinité et la spectrométrie de masse. Cette stratégie nous a permis d’identifier un partenaire, impliqué dans le contrôle de l’adressage de la protéine ceQORH dans le chloroplaste. Alternativement, nous avons réalisé une bio-analyse du protéome de l’enveloppe du chloroplaste et qui nous a permis de revisiter la composition du protéome de l’enveloppe du chloroplaste. Afin d’expliquer la localisation sub-cellulaire variable de la protéine ceQORH, les membres de l’équipe ont émis l’hypothèse d’une interaction probable de cette protéine avec un partenaire cytosolique. Dans la dernière partie de cette étude, nous avons validé l’interaction, in planta, entre ceQORH et son partenaire par une approche génétique qui portait sur l’analyse de l’impact de l’absence de ce dernier sur la régulation de la localisation sub-cellulaire de la protéine ceQORH.Chloroplasts are a major component of plant cells. Their origin traces back to a cyanobacterial ancestor that was engulfed by an ancient eukaryotic cell and eventually integrated as an organelle during evolution. As a result, more than 95% of the ancestral cyanobacterial genes were transferred to the host cell nucleus. Proteins encoded by these relocated genes need to return to internal chloroplast compartments. This import is mainly achieved by the general TOC/TIC machinery located at the chloroplast surface. Until recently, all proteins destined to chloroplast were believed to possess an N-terminal and cleavable chloroplast targeting peptide, and to engage the TOC/TIC machinery. However, recent studies have revealed the existence of several non-canonical preproteins, lacking cleavable transit peptides. The first evidence for such ‘non-canonical’ chloroplast proteins was provided by our team studying the Arabidopsis chloroplast envelope proteome, leading to the identification of a quinone oxidoreductase homologue termed « ceQORH ». Furthermore, a few such proteins were demonstrated to use alternative targeting pathways, independent of the TOC/TIC machinery. To better characterize components of such alternative targeting machineries, a targeted study combining affinity purification and mass spectrometry aiming to identify alternative receptors at the chloroplast surface has been performed. This study allowed us to identify new “partner” involved in the control of chloroplast targeting of ceQORH protein. Alternatively, we also revisited the chloroplast envelope proteome composition and initiated a gene candidate approach. In addition, some non-canonical proteins are shared by plastids and other cell compartments. However, molecular mechanisms controlling subcellular localization of these non-canonical plastid proteins remain unknown. In order to explain the variable subcellular localization of ceQORH protein, our team hypothesized a probable interaction of ceQORH with a cytosolic partner. In the last part of this study, we validated the interaction between ceQORH and its partner in planta by a genetic approach analyzing the impact of the absence of the cytosolic partner on the regulation of the sub-cellular localization of ceQORH protein