DETERMINATION OF THE CONCENTRATION OF NICOTINE AND ITS METABOLITES IN BIOLOGICAL SAMPLES

Ciljevi istraživanja: Razviti metodu za određivanje koncentracija nikotina i njegovih metabolita i biološkom uzorku urina pomoću izrade baždarnih krivulja otopina referentnih standarda poznatih koncentracija te pomoću njih izračunati nepoznate koncentracije u uzorcima urina u kojima su koncentracije nikotina i metabolita nepoznate. Odrediti validacijske parametre navedene metode. Ustroj istraživanja: Eksperimentalna studija Mjesto istraživanja: Kemijsko-toksikološki laboratorij Kliničkog odjela za sudsku medicinu Zavoda za patologiju, sudsku medicinu i citologiju, Kliničkog bolničkog centra u Splitu. Materijal i metode: Otopine za izradu baždarne krivulje dobivene su serijskim razrjeđivanjem referentnih standarda, prvo u metanolu te zatim u uzorku urina, nakon čega su uzeti jednaki volumeni istih koncentracija sve tri tvari te smo pokrili veće koncentracijsko područje. MIX otopine standarda su ekstrahirani metodom tekuće-tekuće (LLE), razrijeđeni kloroformom i analizirani plinskom kromatografijom s masenim spektrometrom snimanjem ukupne ionske struje (TIC). Nakon izrade baždarnih krivulja, slijedi njihova primjena u određivanju koncentracije nikotina i metabolita u realnim uzorcima urina. Rezultati: Umjerne krivulje za nikotin, kotinin i 3-hidroksikotinin uspješno su napravljene pomoću dobivenih signala ciljanim mjerenjem otopina standarda u urinu pri koncentracijama od 0,3-1000 ng/mL. Dokazana je linearnost metode sa koeficjentom korelacije R>0,99. Ponovljivost također zadovoljava kriterij prihvatljivosti (RSD<10%). Masene koncentracije detektiranih nikotina i njegovih metabolita u uzorcima nepoznatih koncentracija izračunate su pomoću prethodno izrađenih baždarnih krivulja. Zaključak: Rezultati ovog istraživanja potvrdili su izbor GC-MS tehnike u kombinaciji sa prethodnom LLE ekstrakcijom željenih analita za kvantitativno određivanje nikotina i njegovih metabolita u biološkim uzorcima urina. Provedeni validacijski faktori zadovoljavaju kriterij prihvatljivosti. Dokazana je prisutnost nikotina i metabolita i u nepušača čime se pokazuje veliki utjecaj pasivnog pušenja na ljude. Daljna istraživanja bi trebala uključivati veliki broj nepušača i razne uvjete izlaganja pasivnom pušenju.Objectives: The objective of this study was to develop a method for simultaneous concentration determination of nicotine and its metabolisms in biological urine sample by making calibration curves using reference standard solutions of known concentrations to calculate unknown concentrations in urine samples. Determine the validation parameters of the specified method. Design: Experimental study Settings: Laboratory of Toxicology, Department of pathology, forensic medicine and cytology, University Hospital of Split. Material and Methods: Calibration solutions were obtained by serial dilution of the reference standards, first in methanol and then in a urine sample, after which equal volumes of the same concentrations of all three substances were taken and a larger concentration area was covered. MIX solutions of the standards were extracted by liquid-liquid (LLE) method, diluted with chloroform and analyzed by total ion current (TIC) gas chromatography with mass spectrometer. After the preparation of the calibration curves, their application is followed in the determination of the concentration of nicotine and metabolites in real urine samples. Results: Calibration curves for nicotine, cotinine, and 3-OH-cotinine were successfully constructed using the obtained signals by the targeted measurement of standard solutions in urine at concentrations of 0.3-1000 ng/mL. The linearity of the method with a correlation coefficient R> 0.99 was proved. Repeatability also meets the eligibility criterion (RSD