Polymeric nanocapsules as versatile platform for the development of new dendritic cell-directed nanovaccines

Therapeutic vaccination against tumor diseases remains a major challenge in immune therapy. The effective activation of dendritic cells by a combination of distinctly acting adjuvants and antigens is essential for success. While conventional vaccine formulations lack the efficiency to trigger sufficient T cell responses in a therapeutic tumor treatment, nanovaccines may offer unique properties to tackle that challenge. In this doctoral thesis, we report the use of polymeric nanocapsules as a versatile platform for the development of new dendritic cell-directed nanovaccines. Those nanocarriers are characterized by a high biocompatibility and modifiability, low cytotoxicity as well as by a large loading capacity for active substances. The resulting nanovaccine comprises a shell consisting of protein antigen and allows an efficient loading with superadditively acting combinations of adjuvants, even when their corresponding receptors are located intracellularly. Furthermore, the capsule surface can be modified with stealth components to increase blood circulation time, allows the functional encapsulation of small interfering RNA and can also be equipped with specific antibodies to substantially increase dendritic cell targeting. Initially, we identified the combination of resiquimod and muramyl dipeptide to exert a superadditive stimulatory potential on dendritic cells. This adjuvant combination maintains its superadditive character and stimulates murine dendritic cells more effective when encapsulated in dextran nanoparticles than when applied directly. At the same time, nanocapsules, consisting of the model antigen ovalbumin, were evaluated as a suitable antigen source for the induction of antigen-specific T cell responses. Subsequently, the aforementioned adjuvant combination was encapsulated in these ovalbumin-based nanocapsules to generate a nanocarrier comprising antigen and superadditive adjuvant combination. Its immunostimulatory potential for dendritic cell stimulation was extensively tested by i) measuring the expression of co-stimulatory markers, ii) the secretion of pro-inflammatory cytokines, iii) the upregulation of immunologically relevant genes on RNA level by transcriptome sequencing, and iv) the capability of accordingly pre-treated dendritic cells to mediate antigen-specific T cell responses. The created nanocapsule, including antigen and adjuvants, triggered strong dendritic cell stimulation and potent antigen-specific T cell proliferation. Moreover, numerous relevant genes were massively upregulated upon treatment. The second step was to equip the protein-based nanocapsule with stealth components to increase its blood circulation time and to reduce unspecific cell interaction. Thereby, a special focus was set on the influence of the molecular weight of the used components as well as on the shielding density and the mass density of the modification. It turned out that such a modification can significantly reduce cellular interaction but is highly dependent on molecular weight, shielding and mass density of the used stealth component as well as on the protein environment. To establish small interfering RNA and targeting moieties in our portfolio of available modifications for polymeric nanocapsules, we switched to a similar, antigen-independent polymeric nanocapsule made of hydroxyethyl starch. Regarding small interfering RNA, we showed that the synthesized nanocapsules were capable of transporting them into dendritic cells and to release them resulting in a functional activity. In terms of targeting, a surface modification with targeting antibodies significantly increased the nanocapsule binding by dendritic cells. Since the introduced protein-based type of nanocapsule provides the option to replace ovalbumin, for instance, by a tumor-related antigen, it also allows a further optimization for personalized tumor treatment by employing a patient’s tumor-specific antigen. In combination with the demonstrated advantages and available modifications, polymeric nanocapsules as presented here constitute a promising platform for the design and generation of new, innovative nanovaccines for tumor treatment.Die therapeutische Impfung gegen Tumorerkrankungen stellt bis heute eine große Herausforderung der Immuntherapie dar. Die Aktivierung von dendritischen Zellen durch die kombinierte Gabe von gezielt wirkenden Adjuvantien und Antigenen ist dabei essentiell. Konventionelle Vakzine sind im Falle einer therapeutischen Tumorbehandlung häufig nicht effizient genug um eine ausreichend starke T-Zellantworten zu induzieren. Demgegenüber weisen Nanovakzine spezielle Eigenschaften auf, die eine therapeutische Vakzinverwendung ermöglichen bzw. erleichtern könnten. In der vorliegenden Doktorarbeit wird die Verwendung von polymeren Nanokapseln als vielseitige Plattform für die Entwicklung neuartiger Nanovakzine beschrieben. Diese Kapseln zeichnen sich vor allem durch eine hohe Biokompatibilität und Modifizierbarkeit, eine geringe Zytotoxizität, sowie durch eine große Ladungskapazität für biologisch aktive Substanzen aus. Das resultierende Nanovakzin weist eine Hülle aus Proteinantigen auf und erlaubt die effiziente Beladung mit superadditiv wirkenden Adjuvanzkombinationen, selbst wenn sich deren Rezeptoren intrazellulär befinden. Zudem kann die Kapseloberfläche mit ‚Stealth‘-Molekülen modifiziert werden, wodurch die Blutzirkulationszeit erhöht wird. Ebenso ermöglicht dieses System die funktionale Verkapselung von small interfering RNA zur Immunmodulation und die Anbindung von Antikörpern zur verstärken Adressierung von dendritischen Zellen. Zu Beginn wurde die Kombination der Adjuvantien Resiquimod und Muramyl-Dipeptid als superadditiv für die Stimulation von dendritischen Zellen identifiziert. Es zeigte sich, dass die stimulierenden Eigenschaften dieser Kombination durch Partikulierung in Dextran-basierte Nanopartikel im Vergleich zur solublen Applikation noch gesteigert werden konnten. Gleichzeitig wurde die Verwendung von Nanokapseln, die aus dem Modellantigen Ovalbumin bestanden, als geeignete Antigenquelle zur Einleitung antigenspezifischer T-Zell-Antworten etabliert. Um ein vollständiges Nanovakzin zu generieren, dass sowohl Antigen als auch eine superadditive Adjuvanzkombination beinhaltet, wurde die zuvor genannte Adjuvanzkombination in diese Antigenkapseln integriert. Das resultierende immunstimulatorische Potential dieser Kapseln wurde anhand i) der Expression kostimulatorischer Marker, ii) der Sekretion proinflammatorischer Zytokine, iii) der Aufregulation immunologisch relevanter Gene auf RNA-Ebene durch Transkriptom-Sequenzierung und iv) der Fähigkeit entsprechend vorbehandelter dendritischer Zellen zur Induktion antigenspezifischer T-Zell-Antworten untersucht. Die generierte Nanokapsel, welche sowohl Antigen als auch Adjuvantien enthielt, induzierte eine potente Stimulation dendritischer Zellen und eine starke Proliferation antigenspezifischer T-Zellen. Zudem wurden unter Gabe der Nanokapseln zahlreiche relevante Gene stark aufreguliert. In einem zweiten Schritt wurden diese proteinbasierten Nanokapseln mit ‚Stealth‘-Komponenten ausgestattet um ihre Blutzirkulationsdauert zu erhöhen und um die unspezifische Interaktion mit Zellen zu reduzieren. Dabei wurde ein spezieller Fokus auf den Einfluss des Molekulargewichts der verwendeten Komponenten sowie auf die Beschichtungs- und Massendichte der Modifikation gesetzt. Es zeigte sich, dass solche eine Modifikation die Interaktion der Nanokapseln mit Zellen signifikant reduzieren kann, der resultierende Effekt allerdings stark von den genannten Einflüssen sowie dem vorherrschenden Proteinmilieu abhängt. Um die Verkapselung von small interfering RNA und die Kopplung von Antikörpern für polymere Nanokapseln zu etablieren, wurden Nanokapseln aus Hydroxyethylstärke verwendet. Bezüglich small interfering RNA, konnte gezeigt werden, dass die synthetisierten Nanokapseln geeignet waren diese in dendritische Zellen zu transportieren und dort freizusetzen. Die resultierende funktionale Aktivität konnte gemessen werden. In Bezug auf die Adressierung von dendritischen Zellen, konnte eine Oberflächenmodifikation mit spezifischen Antikörpern die Nanokapselbindung durch dendritische Zellen signifikant erhöhen. Da das präsentierte proteinbasierte Nanokapselsystem die Option bietet, das Ovalbumin durch beispielsweise ein tumorassoziiertes Antigen zu ersetzen, kann es durch die Verwendung von patientenspezifischen Tumorantigenen weiter in Richtung personalisierte Tumortherapie optimiert werden. Zusammen mit den hier aufgezeigten Vorteilen und möglichen Modifikationen, stellen polymere Nanokapseln eine vielversprechende Plattform für die Synthese von neuartigen, innovativen Nanovakzinen für die therapeutische Tumorbehandlung dar