Insights from Atomic Force Microscopy and Micropipette Aspiration

Um die Funktionalität eines komplexen Nervensystems zu ermöglichen müssen Neuronen höherer Tiere über schnelle und effiziente Mechanismen verfügen. Im Lebenszyklus synaptischer Vesikel spiegelt sich dies in der Endozytose, welche neue Vesikel generiert, der Aufnahme von Neurotransmittern und der Fusionsreaktion, die schließlich Neurotransmitter in den synaptischen Spalt freisetzt um Signale an die nächste Zelle zu übermitteln, wider. Trotz beträchtlicher Fortschritte müssen noch viele Prozesse und Funktionen in diesem Zyklus aufgeklärt werden. Als Beitrag zu diesem Ziel beschreibt diese Arbeit die Untersuchung neuronaler Modellsysteme. Im ersten Projekt wurden aus PC12 Zellen generierte Plasmamembranfragmente mittels Rasterkraftmikroskopie untersucht um topographische Bilder zu erhalten und daraus allgemeine Aussagen über die heterogene Organisation von deren Oberflächen zu treffen. Darüber hinaus wurde versucht die Verteilung von Syntaxin 1 innerhalb der Membranfragmente mittels molekularer Erkennungsbildgebung durch konventionelle Anti- oder Nanokörper welche an die Spitze des Federbalkens eines Rasterkraftmikroskops gebunden wurden zu ermitteln. In rasterkraftmikroskopischen Höhenbildern wurde eine heterogene Struktur der Membranfragmente beobachtet. Durch die Experimente zur molekularen Erkennungsbildgebung wurden keine spezifischen Bindungen identifiziert welche von der großen Anzahl unspezifischer Wechselwirkungen unterschieden werden konnten. Letztere waren auch in Kontrollversuchen vorhanden. Es wurde aufgeklärt, dass die unspezifischen Wechselwirkungen nicht homogen in den Membranfragmenten verteilt sind. Im zweiten Projekt wurde der Einfluss des in synaptischen Vesikeln vorkommenden Proteins Synaptophysin auf die mechanischen Moduln großer unilamellarer Vesikel (GUV) und auf deren generelle Verhaltensweise mittels Mikropipettenaspiration untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine Mikropipettenaspirationseinheit erfolgreich implementiert und ein zur Analyse der Experimente notwendiges Computerprogramm entwickelt. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in den Flächenkompressibilitätsmoduln, dem Biegemodul, der maximalen ersichtlichen Flächendehnung und der maximalen Membranspannung zwischen synaptophysin- und synaptobrevinhaltingen GUV oder reinen Lipidvesikeln festgestellt werden. Dies könnte in der geringen Anzahl verlässlicher Daten begründet sein. Allerdings neigen synaptophysinhaltige GUV während der Aspiration eher zu Fission. Es wurde herausgefunden, dass protein- und insbesondere synaptophysinhaltige GUV zusätzlichen zu den Fissionsereignissen auch unter Erhaltung ihrer Oberfläche Volumen verlieren was möglicherweise auf die Ausbildung eines Kanals hindeutet.Neurons of advanced animals need fast and efficient mechanisms to enable the functionality of a complex nervous system. In the life cycle of synaptic vesicles this is reflected in the endocytosis which generates new vesicles, the uptake of neurotransmitters and the fusion reaction which finally releases the neurotransmitters into the synaptic cleft to propagate the signal to the next cell. Despite considerable effort, many processes and functions in this cycle still need to be unravelled. As a contribution to that aim, this thesis describes the investigation of neuronal model systems. In the first project, plasma membrane sheets derived from PC12 cells were investigated by atomic force microscopy to obtain topographic images for stating generally on the heterogeneity of their surface. Furthermore, it was attempted to infer the distribution of syntaxin 1 inside the membrane sheets by molecular recognition imaging employing conventional antibodies and nanobodies coupled to the tip of atomic force microscopy cantilevers. A heterogeneous structure of the membrane sheets was observed in atomic force microscopy height images. The molecular recognition imaging experiments did not yield specific interactions which could be discriminated from the vast amount of unspecific interactions and the latter were also found in control experiments. The unspecific interaction events were revealed to be distributed non-homogeneously on the membrane sheets. In the second project the influence of the synaptic vesicle protein synaptophysin on the mechanical moduli of giant unilamellar vesicles (GUVs) and on their general behaviour was investigated by micropipette aspiration. To this end, a micropipette aspiration device was successfully implemented and the software necessary for the analysis was developed. The area compressibility moduli, the bending modulus, the maximum apparent area strain and the maximum membrane tension did not show significant differences between GUVs containing synaptophysin and those containing synaptobrevin or pure lipid vesicles. This might be attributed to the low amount of reliable data. However, GUVs containing synaptophysin are more prone to fission during aspiration. GUVs containing proteins and especially those containing synaptophysin were found to lose volume while maintaining their surface area additionally to the fission events possibly indicating the formation of a channel