Feline hemoplasmas : evaluation of specific antibodies and the molecular and cytological diagnostic

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaMycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis are three hemoplasmas responsible for feline hemolytic anemias. The diagnosis of the infection can be performed by observation of the agents on blood smears or by their identification and quantification using PCR techniques, presently considered the gold standard method. A recombinant antigen for Mhf (rDnaK) has been identified, characterized, produced and then successfully applied in Western blot and ELISA assays (rELISA) to detect antibodies in samples from experimentally induced infections. To evaluate this application under field conditions, this rELISA was used in samples collected from naturally infected cats, in parallel with quantitative PCR and cytologic examination. Within the scope of the TNR program implemented by the Lisbon City Council, blood samples were collected from 104 cats. After sample collection, blood was immediately used to prepare blood smears which were then stained with Giemsa (Parasitology Lab, FMV/Lisbon University). The remaining blood was split into two aliquots: 1 – Plasma separation, shipped to Vetsuisse Faculty, Zurich University, for antibody testing with rELISA; 2 – Total DNA extraction for identification and quantification of the three species of hemoplasma using qPCR (Virology Lab, FMV/Lisbon University). Out of 22.1% (N=23) samples where the microorganism was identified by qPCR, mycoplasmas were also identified on the blood smears of 15.4% (N=16). 4.8% (N=5) of samples tested as seropositive and 2.9% (N=3) revealed bordeline results. From 77.9% (N=81) of samples that were negative by qPCR, only 44.2% (N=46) were also negative on cytologic examination. 60.6% (N=63) of samples were considered seronegative and 6.7% (N=7) were borderline. Sensitivity for cytology was 69.6% and specificity was 56.8%. Sensibility of rELISA was 25% and its specificity was 85.1%. Cohen’s Kappa (k) was calculated to assess agreement between PCR-Cytology (k=0.1836) and PCR-rELISA (k=0.1093). Given the low agreement, PCR was found to be the most appropriate diagnostic method. Further studies are necessary to characterize the response of the immune system and the role of different antigens in these infections in order to improve the suitability of rELISA in a clinical settingRESUMO - HEMOPLASMAS FELINOS: AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS E CORRESPONDÊNCIA COM O DIAGNÓSTICO MOLECULAR E CITOLÓGICO - Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis são três hemoplasmas responsáveis por anemias hemolíticas em felinos. O diagnóstico desta infecção pode ser feito pela observação dos agentes em esfregaços de sangue ou através da sua identificação e quantificação pelas técnicas de PCR, sendo este ultimo considerado o método gold standard. Um antigénio recombinante do Mhf (rDnaK) foi identificado, caracterizado, produzido e posteriormente aplicado com sucesso, em técnicas de Western blot e rELISA, para a deteção de anticorpos em amostras colhidas de gatos infetados experimentalmente. De forma a avaliar a sua aplicação numa realidade clínica, esta rELISA foi utilizada em amostras colhidas de gatos naturalmente infectados, em paralelo com o PCR quantitativo e com o exame citológico. No âmbito do programa CED efetuado pela Câmara Municipal de Lisboa, foi realizada a recolha de sangue a 104 gatos. Após a colheita das amostras, o sangue foi utilizado para preparar esfregaços, corados de seguida com coloração Giemsa (Laboratório de Parasitologia, FMV/ULisboa), e dividido em duas alíquotas: 1- Separação do plasma, que foi enviado para a Faculdade Vetsuisse, Universidade de Zurique, onde realizaram a pesquisa de anticorpos com a rELISA; 2 – Extracção do ADN total para a identificação e quantificação das três espécies de hemoplasmas por qPCR (Laboratório de Virologia, FMV/ULisboa). Das 23 (22.1%) amostras PCR positivas, foram igualmente encontrados micoplasmas em 16 esfregaços (15.4%). 5 (4.8%) amostras foram consideradas seropositivas e 3 (2.9%) apresentaram resultados inconclusivos. Das 81 (77.9%) amostras negativas ao PCR, apenas 46 (44.2%) mostraram-se negativas ao exame citológico. 63 (60.6%) amostras foram consideradas seronegativas e 7 (6.7%) apresentaram valores não conclusivos. A sensibilidade da citologia foi de 69.6% e a especificidade foi de 56.8%. Por sua vez, a rELISA apresentou uma sensibilidade de 25% e uma especificidade de 85.1%. O Cohen’s Kappa (k) foi calculado para avaliar a concordância entre o PCR e a Citologia (k=0.1836) e o PCR e a rELISA (k=0.1093). Tendo em conta as baixas concordâncias, o nosso estudo confirma que o PCR é o método de diagnóstico mais adequado. Mais estudos são necessários para caracterizar a resposta imunitária e o papel dos vários antigénios destes agentes, de forma a melhorar a sua aplicação no rELISA e esta poder ser usada no contexto clínico.N/