Spatially multiplexed interferometric microscopy: from basic principles to advanced arrangements

The possibility of visualizing and analysing transparent microscopic objects in a non-invasively manner was one of the addressed challenges in the microscopy field during 20th century. Several microscopy techniques were created for that purpose, including quantitative phase imaging. Quantitative phase imaging provides numerical information about the morphology and the refractive index of such objects, so that it can be very appealing in diverse fields of knowledge such as medicine, biophotonics or life science, just to cite a few. One of the easiest ways of achieving quantitative phase imaging is employing digital holographic microscopy techniques. Digital holographic microscopy arises from the combination of digital holography and optical microscopy. In recent years, many novel digital holographic microscopy approaches have been successfully developed in order to improve their capabilities in terms of robustness, simplicity, usability, accuracy, and price. In line with that, this thesis is focused on the development and improvement of the technique named "Spatially Multiplexed Interferometric Microscopy". This technique introduces minimal modifications in the embodiment of a conventional bright field microscope in order to convert it into a holographic one in an extremely simple, low-cost and highly-stable way. The modifications are aimed to implement a common-path interferometer by a spatially multiplexed approach in the embodiment of the microscope and are mainly three: 1) the replacement of the broadband illumination source of the microscope by a coherent one; 2) the spatial multiplexed of the input plane by dividing it into two or three regions; 3) and the insertion of an interferometric component such as a diffraction grating or a beam splitter cube. All performed arrangements and phase retrieval procedures are focused on the enhancement of such a technique regarding: 1) coherent noise; 2) spatial multiplexed input plane; 3) spatial resolution; 4) ability for reflective samples analysis; 5) refractive index characterization; and 6) real-time analysis. Experimental validations carried out during the thesis demonstrate that spatially multiplexed interferometric microscopy is a powerful, versatile, and low-cost technique for achieving quantitative phase images from a commercially available standard microscope.La posibilidad de visualizar y analizar objetos microscópicos transparentes de una manera no invasiva ha sido uno de los principales retos de la microscopía óptica a lo largo del siglo XX. Para ello, se desarrollaron diversas técnicas de microscopía que convertían las variaciones en el índice de refracción de los objetos en variaciones de intensidad, haciendo estos objetos visibles a simple vista, entre las que destacan la microscopía de contraste de fase de Zernike o de contraste diferencial de Nomarski. Sin embargo, estas técnicas solamente proporcionan información cualitativa del objeto, por lo que su análisis se limita a la simple visualización. Por otro lado, existen otras técnicas de microscopía basadas en la interferometría, que proporcionan información cuantitativa de fase de un modo sencillo y directo. A partir de esta información de fase es posible obtener, de una manera precisa, información sobre la morfología y el índice de refracción del objeto bajo análisis. Este hecho hace que este tipo de técnicas sean muy interesantes en diversas áreas de conocimiento como la medicina, la biofotónica, o la biología, entre otras. Quizás la técnica interferométrica por excelencia para la obtención de imágenes cuantitativas de fase sea la microscopía holográfica digital. La microscopía holográfica digital surge de la combinación de holografía digital y la microscopía óptica. En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos avances en el campo de la microscopía holográfica digital con el fin de introducir mejoras en términos de robustez, simplicidad, precisión y coste. En la misma línea de estos avances, esta tesis está centrada en el desarrollo y la mejora de una técnica llamada “microscopía interferométrica por multiplexado espacial”. Esta técnica se basa en la introducción de una serie de modificaciones sencillas en el cuerpo de un microscopio estándar de campo claro, con el objetivo de convertirlo en uno holográfico de una manera muy robusta, sencilla y económica. Todas las modificaciones realizadas están encauzadas a la implementación de un interferómetro de camino común empleando estrategias de multiplexado espacial en el microscopio. Estas modificaciones son principalmente tres: 1) la sustitución de la fuente de iluminación de banda ancha del propio microscopio por una fuente luminosa coherente que permita interferencias; 2) el multiplexado espacial del campo de visión mediante su división en dos o tres regiones para la transmisión de un haz de referencia; y 3) la inserción de un elemento interferométrico, tal como una red de difracción o un cubo divisor de haz, que produzca el patrón interferencial a registrar. Así pues, todas las técnicas desarrolladas en esta tesis están encaminados a la mejora de esta técnica en términos de: 1) ruido coherente, 2) diseño del campo de visión, 3) resolución espacial, 4) capacidad de análisis de objetos no transparentes, 5) caracterización del índice de refracción, y 6) capacidad de análisis a tiempo real. Todas las validaciones experimentales realizadas durante esta tesis demuestran que la técnica de microscopía interferométrica por multiplexado espacial es una técnica muy versátil, potente y económica que permite la obtención de imágenes cuantitativas de fase a partir de un microscopio de campo claro convencional