Marcadores químicos de la miel asociados al estado metabólico e inmune de colonias de Apis mellifera. Efecto del parásito Nosema ceranae o la aplicación de una composición biocida basada en un extracto vegetal

Tesis Magíster en Bioquímica en el área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico MolecularLa abeja melífera (Apis mellifera) es uno de los insectos polinizadores más importantes, ya que tiene un rol ecológico y económico al polinizar el 16% de las 260.000 especies de angiospermas y el 70% de las especies abastecedoras de alimentos. Actualmente se ha registrado una desaparición rápida de las abejas obreras de las colmenas, lo que se denomina Síndrome de Colapso de Colonias. Una de sus causas probables es el microsporidio Nosema ceranae, el cual a nivel individual induce estrés energético en las abejas, afectando la movilización de reservas de energía, lo que se refleja en la disminución de la prolina en la hemolinfa. Asimismo, disminuye el contenido de proteínas en las glándulas hipofaríngeas, órganos que sintetizan las enzimas que transforman el néctar y polen en miel. Este parásito también afectaría la inmunidad individual, ya que algunos trabajos indican que provoca inmunosupresión en condiciones de laboratorio, mientras que otros reportan una respuesta inmune en colmenas infectadas naturalmente. A nivel social, la colmena es capaz de responder a la infección, ya sea iniciando tempranamente las actividades de recolección de néctar y polen (forrajeo), como sustituyendo a las abejas infectadas. Sin embargo, se desconoce el efecto a nivel social de este parásito en el metabolismo y la inmunidad, los cuales se relacionan con la secreción de prolina y proteínas, así como con el péptido antimicrobiano defensina-1 y la enzima glucosa oxidasa (GOX) en los alimentos de la colmena (jalea real y miel). Por otro lado, puesto que el funcionamiento apropiado del sistema inmune de A. mellifera es clave en la prevención de enfermedades, se han investigado los posibles efectos de HO21, una composición biocida basada en un extracto vegetal, sobre la respuesta inmune de colmenas de A. mellifera. HO21 ha mostrado aumentar la actividad de la colmena, lo que puede atribuirse a ciertos compuestos fenólicos que contiene, los cuales estimulan el sistema metabólico e inmune de las abejas. Dado que la miel contiene azúcares, proteínas, aminoácidos, compuestos fluorescentes, entre otros, que provienen tanto de las sustancias que las abejas recolectan (néctar y polen de flores cercanas a las colmenas, los cuales varían según el origen geográfico), como de las abejas mismas, y gran parte de la colonia participa en su elaboración, se la puede considerar como un componente que refleja el estado metabólico e inmunitario de la colmena que la produce. Por lo tanto, esta tesis plantea que xviii tanto la infección con N. ceranae en las abejas como la aplicación de HO21 estimularán el metabolismo y la inmunidad social, lo que provocará un aumento de marcadores químicos relevantes de la miel, como la concentración de prolina, proteínas totales, fenoles totales, defensina-1, la actividad de GOX y la actividad antimicrobiana. Se analizaron muestras de abejas y miel de 36 colmenas de distintas zonas de la V Región. Además, se analizaron 12 muestras de miel provenientes de 2 colmenas sanas del apiario de la Universidad del Desarrollo de la Región Metropolitana, las que corresponden a muestras obtenidas antes y después de la aplicación de HO21 a estas colmenas. En relación con las muestras de abejas de la V Región, solo una colmena estaba infectada con N. ceranae, por lo que con este número reducido de muestras positivas para este parásito no se pudo determinar su efecto en las variables a analizar en la miel. Sin embargo, en sus muestras de miel correspondientes se evaluaron igualmente los marcadores químicos que reflejan el entorno donde se desarrolla la colmena u origen geográfico (componente externo) y las características propias de los insectos que la componen (componente interno). Se observaron diferencias significativas en el contenido de prolina libre, proteínas totales y fenoles totales entre las distintas áreas geográficas, pero no entre apiarios de una misma zona (salvo algunas excepciones), lo que demuestra el efecto de la flora circundante en la composición de la miel y que aquellos marcadores dan cuenta del componente externo. El análisis de componentes principales (PCA) corroboró esta variabilidad dada por el origen geográfico. En contraste, si bien hubo una variabilidad apreciable en el contenido de defensina-1 y actividad de GOX en las muestras de miel de la V Región, particularmente entre distintas áreas geográficas, las diferencias no fueron significativas para este factor ni entre apiarios de una misma zona. Esto indicaría que la variación de estos marcadores estaría explicada por otros factores, entre los cuales se encontrarían factores genéticos/epigenéticos asociados a la expresión de los genes que codifican para GOX y defensina-1 en las abejas, como lo han documentado otros autores. Por lo tanto, estos marcadores estarían relacionados con el componente interno, ya que sus niveles estarían determinados por la diversidad genética de las abejas. En el caso particular de la defensina-1, dada su masa molecular de 5,5 kDa y la presencia de un residuo de triptófano en su estructura, ésta se cuantificó en la fracción de 3 a 10 kDa de las mieles de la V Región mediante fluorescencia total asociada a MCR-ALS, xix empleando una versión recombinante como patrón. El porcentaje de defensina-1, con respecto al contenido de proteínas en la miel total, estuvo comprendido entre no detectado y 4,7%. Adicionalmente, el péptido fue determinado mediante HPLC con detector de fluorescencia, obteniéndose valores entre no detectado y 7,2x10-4%. La diferencia de magnitudes de los valores de la defensina-1 entre los dos métodos se atribuye a que por HPLC se cuantificaría la forma sin modificar de este péptido, mientras que por fluorescencia total se abarcarían otros compuestos, como por ejemplo, otras formas de la defensina-1, entre las que se encontraría su versión glicada y/o fructada dado el gran contenido de glucosa y fructosa en la miel, conjetura que se está investigando. Con relación a la actividad antimicrobiana de las muestras de miel de la V Región, el 83% de las muestras fue capaz de inhibir por completo el crecimiento de S. aureus y P. aeruginosa. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre las distintas zonas geográficas ni entre apiarios de una misma zona, por lo que esta variable podría estar asociada a otros parámetros no determinados en este trabajo, como el pH y el contenido de azúcares en la miel. Por otro lado, las fracciones de 3 a 10 kDa evaluadas sólo inhibieron el crecimiento de S. aureus. No obstante, el contenido de defensina-1 en éstas no mostró correlación con la actividad antimicrobiana determinada, por lo que esta variable se asociaría a otros factores y no a la presencia de defensina-1 en la fracción. En este sentido, determinar la actividad antimicrobiana de la defensina-1 recombinante corroboraría esta conjetura. Con respecto a las muestras de miel de colmenas tratadas con HO21, si bien se observó un incremento de prolina libre, proteínas totales, fenoles totales y actividad de GOX, ya sea durante o después de la aplicación repetida de HO21, no se presentó una tendencia clara con los otros marcadores. Además, se observó una variabilidad significativa entre las dos colmenas empleadas en el estudio, indicando que hay factores propios de cada colmena que influyen en la respuesta frente a este estímulo. Por último, tampoco se descarta que los resultados obtenidos den cuenta del proceso de maduración propio de la miel en cada colmena. Por ello no se puede asegurar de forma concluyente que la HO21 estimule el metabolismo y/o la inmunidad socialThe honey bee (Apis mellifera) is one of the most important pollinating insects, since it has an ecological and economic role by pollinating 16% of the 260,000 species of angiosperms and 70% of the food supplying species. Currently there has been a rapid disappearance of the worker bees from the hives, which is called Colony Collapse Syndrome. One of its probable causes is the microsporidium Nosema ceranae, which at an individual level induces energy stress in bees, affecting the mobilization of energy reserves, which is reflected in the decrease of proline in the hemolymph. Also, it diminishes the content of proteins in the hypopharyngeal glands, organs that synthesize the enzymes that transform the nectar and pollen into honey. This parasite would also affect individual immunity, since some studies indicate that it causes immunosuppression in laboratory conditions, while others report an immune response in naturally infected hives. At a social level, the hive is capable of responding to infection, either by initiating early nectar and pollen activities (foraging), or by replacing infected bees. However, the effect at the social level of this parasite on metabolism and immunity, which are related to the secretion of proline and proteins, as well as the antimicrobial peptide defensin-1 and the enzyme glucose oxidase (GOX) into the food of the hive (royal jelly and honey), is unknown. On the other hand, since the proper functioning of the immune system of A. mellifera is key in the prevention of diseases, the possible effects of HO21, a biocidal composition based on a plant extract, on the immune response of hives have been investigated. HO21 has been shown to increase the activity of the hive, which can be attributed to certain phenolic compounds it contains, which stimulate the metabolic and immune system of bees. Since honey contains sugars, proteins, amino acids, fluorescent compounds, among others, that come both from the substances that the bees collect (nectar and pollen from flowers near the hives, which vary according to the geographical origin), and from the bees themselves, and a large part of the colony participates in its elaboration, it can be considered as a component that reflects the metabolic and immune state of the hive that produces it. Therefore, this thesis suggests that both the infection with N. ceranae in bees and the application of HO21 will stimulate metabolism and social immunity, which will cause an increase in relevant chemical xxi markers of honey, such as the concentration of proline, total proteins, total phenols, defensin-1, GOX activity and antimicrobial activity. Bees and honey samples from 36 beehives from different zones of the V Region were analyzed. In addition, 12 samples of honey from 2 healthy hives from the apiary of the Universidad del Desarrollo of the Metropolitan Region were analyzed, which correspond to samples obtained before and after the application of HO21 to these hives. In relation to the samples of bees of the V Region, only one hive was infected with N. ceranae, so with this reduced number of positive samples for this parasite, its effect on the variables to be analyzed in honey could not be determined. However, in their corresponding honey samples, chemical markers that reflect the environment where the hive or geographic origin (external component) is developed and the characteristics of the insects that compose it (internal component) were also evaluated. Significant differences were observed in the content of free proline, total proteins and total phenols between the different geographical areas, but not between apiaries of the same area (with some exceptions), which demonstrates the effect of the surrounding flora on the composition of the honey and that those markers account for the external component. Principal component analysis (PCA) corroborated this variability given by geographic origin. In contrast, although there was an appreciable variability in the content of defensin-1 and GOX activity in honey samples from the V Region, particularly between different geographical areas, the differences were not significant for this factor or between apiaries of the same zone. This would indicate that the variation of these markers would be explained by other factors, among which would be genetic/epigenetic factors associated with the expression of genes that code for GOX and defensin-1 in bees, as documented by other authors. Therefore, these markers would be related to the internal component, since their levels would be determined by the genetic diversity of the bees. In the particular case of defensin-1, given its molecular mass of 5.5 kDa and the presence of a tryptophan residue in its structure, it was quantified in the 3 to 10 kDa fraction of the honeys of the V Region through total fluorescence associated to MCR-ALS, using a recombinant version as standard. The percentage of defensin-1, with respect to the protein content in total honey, ranged between undetected and 4.7%. Additionally, the peptide was determined by HPLC with fluorescence detector, obtaining values between not detected and xxii 7.2x10-4%. The difference in magnitudes of the values of defensin-1 between the two methods is attributed to the fact that by HPLC the unmodified form of this peptide would be quantified, while by total fluorescence other compounds would be included, such as, for example, other forms of defensin-1, among which would be its glycated and/or fructated version given the high content of glucose and fructose in honey, conjecture that is being investigated. Regarding the antimicrobial activity of honey samples from the V Region, 83% of the samples were able to completely inhibit the growth of S. aureus and P. aeruginosa. However, no significant differences were observed between the different geographical areas or between apiaries of the same area, so this variable could be associated with other parameters not determined in this work, such as honey pH and sugar content. On the other hand, the evaluated fractions of 3 to 10 kDa only inhibited the growth of S. aureus. Nevertheless, the content of defensin-1 in these showed no correlation with the determined antimicrobial activity, so this variable would be associated with other factors and not with the presence of defensin-1 in the fraction. In this sense, determining the antimicrobial activity of recombinant defensin-1 would corroborate this conjecture. With respect to honey samples from beehives treated with HO21, although there was an increase in free proline, total proteins, total phenols and GOX activity with the repeated application of HO21 and after a certain time of maturation of honey, there was no clear trend with the other markers. In addition, significant variability was observed between the two hives used in the study, indicating that there are factors specific to each hive that influence the response to this stimulus. Finally, it is not ruled out that the obtained results account for the own maturation process of honey in each hive. Therefore, it cannot be conclusively confirmed that HO21 stimulates metabolism and/or social immunit