Fonsecaea pugnacius : ecologia, agrotransformação e potencial de virulência

Orientadora: Prof. (a). Dr(a). Vânia Aparecida VicenteCoorientadora: Prof(a). Dr(a). Renata Rodrigues GomesColaboradora: Dr(a). Juliana Degenhardt-GoldbachDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 15/04/2019Inclui referênciasResumo: A cromoblastomicose é defininda como uma micose de implantação, no qual o agente causal encontra-se no ambiente e se implanta no tecido subcutâneo do hospedeiro através de um trauma normalmente causado por espinhos de plantas vivas, inoculando nos tecidos do hospedeiro estruturas vegetativas e reprodutivas do fungo que irão se transformar em células septadas e pigmentadas, conhecidas como células muriformes, consideradas a forma parasitária da doença. Embora os dados epidemiológicos comprovem a fonte de infecção ambiental da doença, os aspectos associados a ecologia e virulência destes agentes ainda não estão totalmente elucidados, sendo necessário o estabelecimento de modelos biológicos adequados para o melhor entendimento ddos mecanismos de virulência envolvidos na evolução clinica desta doença. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens de Fonsecaea pugnacius, um dos agentes causais da cromoblastomicose, visando obter uma linhagem de origem clínica marcada molecularmente para estudos do potencial de virulência e mecanimos de infecção. A linhagem transformada foi aplicada em modelos de estudo da relação parasita/hospedeiro e da mesma forma utilizada para investigar os mecanismos relacionados à rota de infecção. Um total de 43 transformantes com o plasmídeo controle (pAD1625) e 3 com o plasmídeo contendo o gene de fluorescência (DsRed) foram obtidos (pCAMDsRed). Os mutantes obtidos por meio de transformação mostraram-se estáveis, porém não fluorescentes. Entretanto, a transformação foi confirmada por PCR primer-especifico. Dois organismos com cada plasmídeo foram selecionados aleatoriamente inoculados nos três espécimes vegetais selecionados como hospedeiros para os testes in vitro (Bactris gasipaes, Butia odorata e Mimosa pudica). Amostras de plantas contaminadas e da solução fúngica contendo 107cels/mL da linhagem transformada de F. pugnacius foram inoculadas via lesão traumática em camundongo BALB/c. De acordo com os resultados iniciais foi possível visualizar sinais de inflamação nos animais inoculados com espinhos contaminados, nos quais foi possível observar estruturas fúngicas vegetativas no local da lesão traumática. Tais resultados indicam a capacidade de infeção via inoculação traumática e um possível caminho para demostração da rota de infecção de F. pugnacius. Além disso, este estudo confirmou o potencial de infecção e a habilidade de sobrevivência deste agente em tecidos vegetais. No entanto, variações deste modelo e comparações com outras espécies são imprescindíveis para a elucidação dos mecanismos de infecção da espécie em questão. Palavras-chave: Fonsecaea pugnacius, micose de implantação, rota de infecção, modelos de infecção, cromoblastomicose.Abstract: Chromoblastomycosis is an implantation mycosis, wherein the etiological agent present in environmental material is inoculated in the subcutaneous tissue of the host through a trauma, usually with plant spines, inoculating fungal vegetative and reproductive structures into host tissues. Fungal structures in host tissue can become septate and pigmented cells, known as muriform cells that are considered the parasitic form of the disease. Although epidemiological data show the environmental origin of the disease, the ecology and virulence of the agents have not been fully elucidated. Therefore, the establishment of biological models is essential for this elucidation. In this context, the objective of this work was use the Agrobacterium mediated transformation (ATMT) of the Fonsecaea pugnacius, one of the agents of the disease, in order to obtain a clinical strain molecularly marked. The transformants was applied in animal models to investigate the mechanisms of infection and virulence. A total of 43 transformants with the control plasmid (pAD1625) and 3 with the plasmid containing the fluorescence gene (DsRed) were obtained (pCAMDsRed). Moreover, the mutants obtained were not fluorescent, they were stable and the ATMT was confirmed by primer-specific PCR. A random selection of two (n=2) transformtants expressing gene markes of each plasmid was performed and these were inoculated into three plant Bactris gasipaes, Butia odorata and Mimosa pudica cultured in vitro. Samples of infected plants and as well the fungal solution containing 107cels/mL of the mutant strain of F. pugnacius were inoculated by traumatic lesion in animal model BALB/c mice. Inflammatory signs were present only when the animal tissue was inoculated with contaminated spines, being observed vegetative fungal structures at the site of the inoculation. Such results indicate the capacity of infection by traumatic inoculation and represent a possible demonstration of F. pugnacius infection pathway. In addition, this study confirmed the infection potential and the survival ability of this agent in plant tissues. However, variations of the models used and comparison with other species are required in order to elucidate the mechanisms of infection. Key words: Fonsecaea pugnacius, implantation mycosis, route of infection, infection models, chromoblastomycosis