In vitro Studien zum Einfluss bestrahlter Kopf-Hals-Tumorzellen auf die Differenzierung humaner Monozyten zu Makrophagen

1.1 Hintergrund und Ziele Plattenepithelkarzinome der Kopf-Hals-Region gehören mit zu den häufigsten Tumorerkrankungen. Risikofaktoren für deren Entstehung sind in erster Linie ausgeprägter Alkohol- und Tabakkonsum, jedoch auch die Infektion mit einem Hochrisiko-Typ des Humanen Papillomavirus (HPV). Patienten mit HPV-positivem Status sprechen allerdings besser auf eine Radiotherapie (RT) an, aber die dafür verantwortlichen biologischen Prozesse sind noch nicht vollständig untersucht. Kopf-Hals-Tumore werden im Falle einer Radiotherapie mit normofraktionierter Bestrahlung behandelt, aber in den letzten Jahren rückte auch die hypofraktionierte Bestrahlung immer mehr in den Fokus. Es ist von großem Interesse herauszufinden, welchen Zelltodesformen nach hypo- oder normofraktionierter Bestrahlung die Tumorzellen unterliegen, da jene unterschiedliche immunologische Auswirkungen haben. Die Seneszenz, ein stress-induzierter Arrest des Zellzyklus und Folge von Bestrahlung, scheint hierbei besonders großen Einfluss auf das Immunsystem zu haben. Es wurde bereits gezeigt, dass das Tumormikromilieu einen starken Einfluss auf die antitumorale Immunreaktion hat, welche durch die Radiotherapie induziert werden kann. Makrophagen gehören zur angeborenen Immunantwort und entstehen aus Monozyten. Sie spielen eine zentrale Rolle in der Interaktion von Tumorzellen mit dem Immunsystem. Der Tumor benutzt diese für Angiogenese und Expansion. Diese infiltrierenden Makrophagen werden auch „Tumor-assoziierte Makrophagen“ (TAM) genannt und korrelieren mit einem negativen Therapieerfolg. Es ist bekannt, dass Makrophagen eher inflammatorische (M1) und antiinflammatorische (M2) Phänotypen ausbilden können, wobei die TAM eher dem M2-Phänotyp ähneln. Jedoch unterliegt der Phänotyp einer hohen Plastizität und kann daher nur als Hinweis auf eine eher pro- oder antiinflammatorische Immunantwort gesehen werden. Daher sollte der Einfluss der sekretierten und freigesetzten Substanzen von Kopf-Hals-Tumorzellen in Verbindung mit deren HPV-Status auf den Makrophagen-Phänotyp untersucht werden. 1.2 Methoden Es wurden in vitro Studien mit vier humanen Kopf-Hals-Tumorzelllinien durchgeführt, von denen die Hälfte das HP-Virus trägt. Die Zellen wurden entweder mit normo- (5x2Gy) oder hypofraktionierter (2x5Gy) ionisierender Strahlung behandelt. Zwei bzw. sechs Tage nach der letzten Bestrahlung wurden die vorliegenden Zelltodesformen und die Seneszenzentstehung betrachtet. Die Zelltodesanalyse erfolgte mittels AnnexinV-Propidiumiodid-Färbung und die Seneszenz-Analyse mittels einer Bafilomycin-C12-Färbung. Die Messungen wurden mit einem Durchflusszytometer durchgeführt. Der zellfreie Überstand der Tumorzellen wurde für Experimente mit humanen Makrophagen gesammelt, um deren Reaktion auf das Tumormikromilieu zu beobachten. Für diese Versuche wurden Monozyten aus humanem Blut über eine Dichtegradientenzentrifugation und eine magnetische CD14+-Selektion gewonnen. Diese wurden in einer Mischung aus Medium und dem Tumorzellüberstand ausgesät und für sechs Tage inkubiert, wodurch sie zu Makrophagen differenzieren können. Dann wurden die Makrophagen mit Durchflusszytometrie auf charakteristische M1-(HLA-DR und CD80) und M2-(CD163 und CD206) Oberflächenmarker hin untersucht. 1.3 Ergebnisse Die Daten weisen darauf hin, dass der Zelltod in Kopf-Hals-Tumorzellen nach Bestrahlung nicht vom HPV-Status abhängig ist, sondern vielmehr als sehr individuelles Tumor-Charakteristikum gesehen werden muss. HPV-positive Zellen zeigen im Vergleich leicht erhöhte Nekroseraten. Es wurden keine ausschlaggebenden Unterschiede in den Zelltodesformen nach hypo- oder normofraktionierter Bestrahlung beobachtet. Bei der Analyse der Seneszenz wurden insgesamt höhere Seneszenz-Raten in den HPV-positiven Tumorzelllinien im Allgemeinen und tendenziell mehr Seneszenz nach hypofraktionierter Bestrahlung festgestellt werden. Der Tumorzellüberstand beeinflusste die Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen. Eine Tendenz in Richtung des M2-Phäntotyps konnte für alle Tumorzelllinien festgestellt werden. Eine hohe Expression des CD206-Markers nach Inkubation mit Überständen von bestrahlten HSC4-Zellen, insbesondere hypofraktioniert bestrahlten, war zu verzeichnen. Die Ergebnisse waren insgesamt abhängig von der individuellen Zelllinie. 1.4 Zusammenfassung und Ausblick Die Ergebnisse bestätigten, dass der Makrophagen-Phänotyp einer sehr hohen Plastizität unterliegt, vor allem im Tumormikromilieu. Dieser scheint sehr individuell durch die Bestrahlung beeinflusst zu werden. Dies bestätigt, dass auch bei Kopf-Hals-Tumoren die individuell unterschiedlichen Interaktionen zwischen dem Immunsystem und dem Tumor bei der Therapie und in der Forschung beachtet werden müssen. In zukünftigen Experimenten sollte der Einfluss auf den Makrophagen-Phänotyp, sowohl vom Tumormikromilieu als auch von den Tumorzellen selbst, betrachtet werden.2.1 Background Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is one of the most common tumor diseases worldwide. Risk factors are alcohol and tobacco consume or infection with a high-risk human papillomavirus (HPV)-type. Patients with HPV+ status respond better to radiotherapy (RT), but the causal biological processes are not yet fully understood. HNSCC is treated with normofractionated RT, but in the last decade hypofractionated RT came into the focus of research and therapy. It is of interest to determine which cell death forms tumor cells undergo after normo- or hypofractionated RT, as the latter can lead to different immunological responses. Also, senescence, a stress-induced form of cell cycle arrest, also after RT, is predicted to have high influence on the immune system. In addition to that, we were interested in how the HPV-status impacts this. Furthermore, the potential of supernatants of treated tumor cells to impact on macrophage phenotype was examined, since the tumor microenvironment has been demonstrated to be strongly involved in therapy-induced anti-tumor immune reactions. Macrophages are part of the innate immune system and develop out of monocytes. They play an important role in the interaction of tumors cells with the immune system. Tumors utilize macrophages for angiogenesis and to expand. These infiltrating macrophages are called “tumor-associated macrophages” (TAM) and correlate with a poor outcome. It is known that there are more pro-inflammatory phenotypes (M1) and more anti-inflammatory phenotypes (M2). TAMs are more similar to the M2-phenotype. But as macrophages have high plasticity, the phenotype should be regarded as an indication only for pro- or anti-inflammatory reactions. 2.2 Methods In vitro experiments were carried out with four human HNSCC cell lines of which two are bearing the HP virus and two are not. Cells were seeded and treated with X-Rays either normo- (5x2Gy) or hypofractionated (2x5Gy). Two days and six days after last fraction of RT, cells were analyzed regarding their cell death and senescence. Cell death analyses were carried out with AnnexinV-Propidiumiodid-staining and senescence analyses with Bafilomycin-C12-Staining. Both were measured with flow cytometry. The cell free supernatant of the irradiated cells was kept. Human monocytes were isolated out of concentrated blood via density gradient centrifugation and CD14+ selection by magnetic labeling. The monocytes were grown in a mixture of medium and the tumor supernatant from the HNSCC-cells. In the incubation time of six days, the monocytes differentiated to macrophages and the cells were then measured with flow cytometer for the macrophage characteristic markers HLA-DR (M1), CD80 (M1), CD163 (M2) and CD206 (M2). 2.3 Results Our data suggests that cell death induction of HNSCC cells does not depend on the HPV-status, but is rather a very individual tumor characteristic. HPV+ cells show slightly increased rates of necrosis. No common difference in the cell death forms between hypo- and normofractionated RT is observed. Senescence experiments show an overall higher percentage of senescent cells in the HPV+ cell lines. There is a tendency that hypofractionated RT induces more senescent cells than normofractionated RT. The tumor cell supernatant of HNSCC cells impacts on monocyte differentiation. Here, a tendency towards a M2-phenotype is observed for all examined cell lines. The results are dependent on the individual cells. In HSC4 cells a high expression of CD206 resulting from incubation with SN of irradiated tumor cells is observed, especially with the usage of hypofractionationated RT. 2.4 Conclusion and outlook Our results confirm that macrophages have high plasticity in their phenotype in the tumor microenvironment, which seems to be individually influenced by RT. This also confirms that in HNSCC the different and individual interactions between the immune system and the tumor have to be taken into account. In future experiments the impact of both, tumor cell supernatant and the tumor cells themselves on macrophage phenotype, should be examined