Izolacja autoantygenu przysadkowego metodą chromatografii powinowactwa

Introduction: In sera of pituitary disease patients and other autoimmune endocrine disease are detectable pituitary autoantibodies. Until now characterization of pituitary antigen is still unknown. The aim of our study was isolation and characterization of pituitary autoantigen by affinity chromatography. For isolation we have used microsomal fraction of human pituitary. Material and methods: For immunoglobulins isolation have been used sera of pituitary disease, Addison disease and Graves-Basedow disease patients with detectable pituitary autoantibodies. For pituitary antigen isolation have been used microsomal fraction of human pituitary obtained by ultracentrifugation and solubilisation. Immunoglobulins isolation was performed on Sepharose 4B–Protein A. Immunosorbent was performed on CNBr-activated Cl-4B Sepharose. Desorbtion was conducting by 0.2 mol/L glicine and 1 mol/L, 3 mol/L guanidine. The estimation of isolated proteins was performed by immunoblotting. Results: Isolation of immunoglobulins from patients sera was done 12 times receiving from 8.5 up to 13.5 mg of IgG from 1-1.5 ml of sera. In desorbtion we have received from 0.026 up to 0.150 mg of antigen proteins. For molecular weight estimation isolated proteins have been labeled by 125I and run on SDS/PAGE with autoradiography. Autoradiography shown us two lines with 67 kDa and 55 kDa and low weight protein line. Conclusions: Isolation of pituitary autoantigen by affinity chromatography shown two different antigen proteins with 67 kDa and 55 kDa.Wstęp: Na podstawie wcześniejszych badań można stwierdzić, że przeciwciała przysadkowe skierowane przeciw autoantygenom frakcji mikrosomalnej ludzkich przysadek występują w surowicach pacjentów z chorobami przysadki, jak również u pacjentów z chorobami autoimmunizacyjnymi gruczołów dokrewnych. Dotychczas nie udało się jednak dokonać szczegółowej charakterystyki antygenu przysadkowego. Dlatego celem niniejszej pracy była próba izolacji autoantygenu przysadkowego metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem surowic chorych o wysokim mianie autoprzeciwciał przysadkowych, oraz frakcji mikrosomalnej ludzkich przysadek. Materiał i metody: Do izolacji immunoglobulin użyto surowic pacjentów z chorobami przysadki, chorobą Addisona oraz chorobą Gravesa- Basedowa, które wykazywały silną reakcję immunologiczną z antygenami przysadkowymi w metodzie immunoblottingu. Do izolacji antygenu przysadkowego użyto frakcji mikrosomalnej ludzkich przysadek, otrzymanej drogą ultrawirowania i solubilizacji. Izolację immunoglobulin przeprowadzono na kolumnie sefaroza 4B-białko A, które następnie wykorzystano do sporządzenia immunosorbentu na CNBr-aktywowanej sefarozie. Desorpcji białek antygenowych dokonano przy użyciu glicyny (0,2 mol/l) oraz guanidyny (1 mol/l i 3 mol/l). Ocenę wyizolowanych białek przeprowadzono metodą immunoblottingu. Wyniki: Izolację immunoglobulin z surowic chorych przeprowadzono 12-krotnie, otrzymując 8,5-13,5 mg IgG z 1-1,5 ml surowicy. W wyniku desorpcji antygenów przysadkowych z immunosorbentu otrzymano 0,026-0,150 mg białek antygenowych. Dla określenia masy cząsteczkowej i czystości antygenu mikrosomalnego przysadek uzyskanego drogą chromatografii powinowactwa, wyizolowane białka były znakowane izotopem 125I oraz rozdzielone elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) z następową autoradiografią. Wyniki autoradiogramów wykazały obecność dwóch silnie zaznaczonych prążków białek o masie 67 kDa i 55 kDa oraz białka niskocząsteczkowe. Wnioski: Izolacja autoantygenu przysadkowego z zastosowaniem metody chromatografii powinowactwa pozwoliła otrzymać dwie frakcje białek antygenowych o różnych ciężarach właściwych - 55 kDa i 67 kDa