Obtención, caracterización y evaluación de cepas atenuadas de Vibrio cholerae para fines vacunales

Ante la inexistencia de una vacuna contra Vibrio cholerae O1 de biotipo El Tor, el agente etiológico más frecuente del cólera, se construyen dos plasmidios suicidas: pAJF y pGPH6, destinados a atenuar la virulencia de cepas patógenas con fines vacunales. Al construir pAJF se descubre que en el gen ctxA del operón ctxAB del profago CTXΦ se inician transcriptos codificantes de la subunidad CtxB de la toxina colérica. Luego, mediante el empleo de pAJF se deleciona el profago CTXΦ de las cepas C6706 (El Tor Inaba) y C7258 (El Tor Ogawa) y se obtienen 413, 417, 81, 82, 84, 87, y 88 y se demuestra que 413 y 81, a diferencia de C7606 y C7258, no producen toxina colérica in vitro, ni tienen efecto letal en ratones Balb/c lactantes. Luego, a las cepas 413 y 81 se les reemplaza el gen codificante de la hemaglutinina proteasa por un alelo interrumpido por el gen celA (endoglucanasa A) de Clostridium thermocellum proveniente del plasmidio pGPH6 y se demuestra que las cepas resultantes 638, 631 y 1333 no producen Hap y sintetizan endoglucanasa A activa, lo que permite distinguirlas mediante un ensayo simple. Se demuestra que la expresión de celA y la inactivación de hap no perjudican la atenuación ni la colonización intestinal de las cepas en ratones Balb/c lactantes y se concluye que celA es un gen marcador apropiado para V. cholerae y hap un locus útil donde insertarlo. Se identifica una mutación colateral en el gen toxR de la cepa 638 que limita la expresión de la fimbria TCP y atenúa la colonización y se encuentra que 638 solo se infecta con el bacteriófago CTXΦ tras colonizar el intestino, a diferencia de 81, 631, 413 y 1333 que son susceptibles in vitro. Se demuestra que tras infectarse con CTXΦ, las cepas 81,631, 413 y 1333 producen la toxina colérica y tienen efecto letal en ratones lactantes, a diferencia de 638 que permanece significativamente atenuada. Se demuestra además que 638 no se infecta con el fago VGJΦ, un mediador alternativo de la trasmisión de CTXΦ y se concluye que 638 es más segura que las restantes. Se pasa entonces a la prueba de concepto de 638 en voluntarios, donde se obtiene que una dosis oral de 109 UFC induce síntomas ligeros a una frecuencia indistinguible del placebo, despierta una respuesta sérica de anticuerpos inhibidores del crecimiento bacteriano y protege a un grupo reducido de voluntarios de contraer el cólera al retarlos con la cepa patogénica 3008 (El Tor Ogawa). Se concluye que se debe avanzar a la fase de desarrollo tecnológico de 638 y a la evaluación clínica de lotes producidos cumpliendo las buenas prácticas de manufactura