Studies of the mucosal gene expression defects in inflammatory bowel diseases before and after control of inflammation

SAMENVATTING De ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) zijn chronische inflam matoire darmziekten (IBD) met (bloederige) diarree en abdominale pijn al s belangrijkste symptomen. IBD treft voornamelijk jonge volwassenen en g aat gepaard met een sterk verminderde levenskwaliteit. De pathogenese va n IBD is niet gekend, maar alles wijst erop dat de chronische darmontste king bij IBD het gevolg is van een onaangepaste en blijvende activatie v an het mucosale (slijmvlies) immuunsysteem gericht tegen de normale darm microbiota in genetisch vatbare personen. Deze afwijkende immuunrespons wordt waarschijnlijk bevorderd door defecten in zowel de barrière functi e als in het mucosale immuunsysteem van de darm. Nieuwe inzichten in de IBD pathogenese hebben geleid tot de ontwikkeling van biologische therap ieën. Infliximab, een chimere monoclonale IgG1 antistof tegen TNF-α , is de eerste klinisch beschikbare biologische therapie voor IBD. Dankz ij infliximab is de levenskwaliteit van vele patiënten sterk verbeterd e n is er een vermindering in hospitalisaties en operaties bij de patiënte n. Bovendien is infliximab de eerste medicatie voor IBD die een snelle e n volledige heling van de darmontstekingletsels kan induceren. 20 tot 30 % van de patiënten reageert echter niet op de behandeling. De oorzaak va n deze resistentie tegen infliximab bij IBD patiënten is niet duidelijk en predictoren om een antwoord op de therapie te voorspellen ontbreken m omenteel. De doelstelling van deze doctoraatsthesis was om de mucosale genexpressi e afwijkingen geassocieerd met actieve CD en UC te bestuderen, en om tev ens het effect van de onderdrukking van de ontsteking en mucosale heling geïnduceerd door infliximab therapie op deze afwijkingen na te gaan. We maakten gebruik van genexpressie microarray technologie op endoscopisch afgenomen darmmucosa biopten van patiënten met actieve IBD vóór en na h un eerste behandeling met infliximab en van controle individuen. De micr oarray technologie stelt ons in staat om de expressie niveaus van duizen den genen van een enkele individu tegelijk te meten. Hierdoor kan de afw ijkende genexpressie gedetecteerd worden door vergelijkingen te maken tu ssen de genexpressie profielen van patiënten, behandelde patiënten en co ntroles. In het eerste deel van dit werk onderzochten we de mogelijkheid om de re spons op infliximab te voorspellen met behulp van de darmmucosa genexpre ssie microarray profielen. We bestudeerden de genexpressie profielen vóó r infliximab behandeling om de primaire responders (patiënten die antwoo rden op infliximab) van de non-responders (patiënten die niet antwoorden op infliximab) te onderscheiden in UC, in de ziekte van Crohn van het c olon (CDc) en in de ziekte van Crohn van het ileum (CDi). We identificee rden een predictieve set van mucosale genen die de respons op infliximab in UC en in CDc kan voorspellen. Verder observeerden we een grote overl ap van de predictieve genen tussen UC en CDc. Dit suggereert dat het mec hanisme van resistentie op infliximab therapie gelijkaardig is voor beid e ziekten. Bovendien voorspelde de UC predictieve set van genen ook zeer accuraat de respons op infliximab in CDc. Deze predictieve genen vertoo nden vóór behandeling een lagere genexpressie in de responders versus no n-responders. De proteïnen gecodeerd door deze genen spelen voornamelijk een rol in de mucosale immuunreactie. In tegenstelling tot UC en CDc ve rtoonde slechts 1 CDi patiënt een volledige heling van het ileum. Zelfs door gebruik te maken van minder strenge responscriteria voor infliximab therapie, konden we geen genen identificeren die voorspellend waren voo r de respons op infliximab in CDi. De mogelijkheid om de ontsteking volledig uit te schakelen en een mucosa le heling te induceren in IBD patiënten door infliximab therapie laat on s toe om een onderscheid te maken tussen de primaire mucosale defecten e n de mucosale defecten ten gevolge van de ontsteking in de darm. Daarom onderzochten we in het tweede deel van deze thesis de genexpressie profi elen in het darmslijmvlies van actieve IBD patiënten vóór en na hun eers te infliximab therapie, en dit in vergelijking met de genexpressie profi elen in het normale darmslijmvlies van personen die niet lijden aan IBD. Voor deze studie hebben we ons gericht op de genexpressie van antimicro biële peptiden (AMP s), cel adhesie moleculen (CAM s), matrix metallopro teinasen (MMP s), metalloproteinase gerelateerde moleculen en groeifacto ren. Eerst bestudeerden we de genexpressie van AMP s in IBD mucosa. AMP s wor den geproduceerd door de darmepitheelcellen om de darmmucosa te bescherm en tegen de luminale micro-organismen. Een abnormale expressie van AMP s werd herhaaldelijk beschreven in IBD, maar het blijft onduidelijk of he t gaat om een primair defect of een defect ten gevolge van de slijmvlies ontsteking in IBD. We bevestigden dat er belangrijke afwijkingen in de A MP expressie bestaan in IBD patiënten met actieve ziekte, maar uitschake ling van de ontsteking door infliximab verbeterde of herstelde de expres sie van de meeste van deze afwijkingen in IBD responders, waaruit blijkt dat deze afwijkingen vermoedelijk het gevolg zijn van de ontsteking. De afwijkingen die toch aanwezig bleven na infliximab behandeling in IBD r esponders konden we in verband brengen met een nog steeds gedaalde epith eelmassa van de darmmucosa na heling, toch nog een licht toegenomen onts tekingsactiviteit of Paneth cel metaplasie. Hoewel een AMP defect als oo rzaak van IBD onwaarschijnlijk is, denken we dat de geïdentificeerde afw ijkingen in AMP expressie toch een belangrijke rol kunnen spelen in het voortbestaan van de darmschade als gevolg van de gebrekkige verwijdering van de binnendringende micro-organismen. Ten tweede bestudeerden we de genexpressie van leukocyten/endotheliale C AM s, chemokines en hun receptoren in het IBD darmslijmvlies. Deze molec ulen regelen de migratie van witte bloedcellen (leukocyten) uit de bloed baan naar de ontstekingsplaatsen. In IBD is er een continue instroom van leukocyten in de ontstoken darm. Een interessante manier om IBD te beha ndelen is het blokkeren van de migratie van deze leukocyten door de inte ractie van CAM s en chemokine receptoren te blokkeren met hun liganden. Er is reeds 1 anti-migratie therapie ontwikkeld voor IBD, namelijk natal izumab, maar betere en meer darmselectieve therapieën zijn nodig. We kon den aantonen dat de genexpressie van een groot aantal CAM s, chemokines en chemokine receptoren sterk toegenomen was in het ontstoken darmslijmv lies bij IBD, maar onderdrukking van de ontsteking door infliximab verbe terde of herstelde de expressie van de meeste van deze abnormaliteiten i n IBD responders. Hoewel de colonexpressie van de chemokines CCL20 en CX CL1-2 daalde na infliximab therapie in IBD responders bleef hun colonexp ressie significant hoger na therapie in IBD responders vergeleken met de controles. Dit zou kunnen verklaren waarom mucosale letsels snel terugk omen wanneer de patiënten geen onderhoudsbehandeling met infliximab krij gen. De meest interessante kandidaat voor anti-migratie therapie naast i nhibitie van de α4ß7-integrin-MADCAM1 as is PECAM1 omdat de genexpressie van PECAM1 sterk verhoogd was in het ontstoken colon en in het ontstoken ileum van IBD patiënten. Chemokines als doelwit zoals b ijv. CCL20 en IL8 lijken eveneens zeer interessant omwille van hun sterk verhoogde expressie in de IBD darmmucosa, maar deze zijn niet darmspeci fiek. We observeerden dat de darmspecifieke CCL25 (TECK)-CCR9 as daarent egen geen goede kandidaat is omdat TECK enkel tot expressie kwam in het ileum, de expressie niet verhoogd was in IBD en er geen effect was van i nfliximab therapie op de expressie van TECK. Ten derde onderzochten we de mucosale genexpressie van MMP s en hun inhi bitoren, ADAM(TS) s (metalloproteinase gerelateerde moleculen) en groeif actoren. Deze moleculen zijn belangrijke spelers in het hermodelleren va n het weefsel tijdens de opeenvolgende processen van ontsteking, weefsel schade en weefselherstel. In IBD is er een verstoring van de balans tuss en weefselschade en weefselherstel wat resulteert in typische letsels zo als zweren en fibrotische vernauwingen. We vonden dat een groot aantal v an de MMP s, TIMP s, ADAM(TS) s en groeifactoren een verhoogde genexpres sie vertoonde in actieve IBD. Na controle van de ontsteking met inflixim ab vertoonden de meeste van deze genen geen abnormale expressie meer in IBD responders, terwijl in de IBD non-responders de expressie van de mee ste van deze genen abnormaal bleef na infliximab therapie. Verder vonden we dat de verhouding van de expressie van MMP s/TIMP s verhoogd was bij actieve IBD vóór behandeling met als resultaat een netto verhoogde MMP activiteit. Dit levert zeker een bijdrage tot de darmschade in IBD. De M MP/TIMP expressie verhouding normaliseerde na infliximab behandeling in IBD responders welke een weerspiegeling is van de complete mucosale heli ng in de responders na therapie. Als besluit kunnen we stellen dat de bevindingen in deze thesis bijdrage n tot het beter begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen o p het niveau van het darmslijmvlies in IBD. Momenteel bestuderen we de m ucosale afwijkingen in de expressie van genen betrokken in de epithelial e barrière functie in IBD. Verder willen we ook inzicht krijgen in het o ntstaan van de meest vroegtijdige letsels van CD door het model te bestu deren van het vroegtijdig heroptreden van de ziekte na operatie (het weg nemen van het ontstoken darmgedeelte). Ook hier zullen we gebruik maken van de genexpressie microarray technologie.status: publishe