Influence of PEGylated cholecystokinin, meal feeding ang ghrelin on the energy balance in rats

In het kader van de steeds toenemende obesitas problematiek, is de zoekt ocht naar een effectief geneesmiddel om de eetlust af te remmen en om li chaamsgewichtstoename tegen te gaan, de laatste jaren sterk toegenomen.& nbsp; Maar om een aandoening zoals obesitas in te dijken, is het noodzak elijk te achterhalen waardoor obesitas veroorzaakt wordt. Obesitas komt voort uit een onevenwicht in de energiebalans, een complex geheel dat gereguleerd wordt door een veelvoud aan interacties tussen de hersen en en de periferie. Een van die perifere signalen is het darmpepti de cholecystokinine (CCK), een verzadigingshormoon dat bij aankomst van nutriënten in het darmkanaal wordt vrijgezet in het duodenum, teneinde d e hersenen te informeren over de nutritionele toestand van de periferie. Hoewel CCK, sedert de ontdekking van zijn anorexigene werking in 1973 (Gibbs et al.), al intensief bestudeerd werd, zijn er tot op heden nog steeds controversies omtrent het werkingsmechanisme van CCK. E en obstakel dat verder onderzoek hindert, is CCK s bijzonder korte biolo gische halfwaardetijd. Om dit probleem te omzeilen, hebben we de h alfwaardetijd van CCK recent succesvol verlengd door PEGylatie, een proc es waarin een polyethyleen glycol (PEG) covalent aan het molecule wordt gehecht. Een eerste studie toonde aan dat het 10kDa gePEGyleerd co njugaat (PEG-CCK9) het meest effectief was in het verlengen van het anor ectisch effect van CCK (Leon-Tamariz et al. 2007). Zoals voor elk nieuw ontwikkeld peptide, moeten de farmacologische, farmacokinetische e n fysiologische karakteristieken van PEG-CCK9 geëvalueerd worden. Het huidig doctoraatsonderzoek legde zich dan ook toe op de evaluatie va n de farmacologische en metabole karakteristieken van 10kDa PEG-CCK9 in de rat. In een eerste deel van dit werk werd de anorexigene capaciteit van versc hillende dosissen van PEG-CCK9 geëvalueerd in ratten met vrije toegang t ot voeder, en werd aan de hand van selectieve CCK-receptor antagonisten, nagegaan welke receptoren hiervoor verantwoordelijk zijn. PEG-CCK 9 veroorzaakte via stimulatie van perifere CCK1-receptoren, een duidelij k dosisafhankelijk effect op zowel de duur als de initiële intensiteit v an de anorexie. Aangezien gePEGyleerd CCK resulteerde in een voede rinname reductie die langer aanhield dan deze veroorzaakt door het ongem odificeerde CCK, werd onvermijdelijk de vraag gesteld of PEG-CCK9 ook ef fectief blijft bij langdurige toediening en zo het lichaamsgewicht kan b eïnvloeden. Een experiment waarin ratten gedurende 14 opeenvolgend e dagen dagelijks een intraperitoneale injectie van 8µg kg-1 PEG-CCK9 kr egen, wees uit dat PEG-CCK9 in deze dosis wel elke dag een 3 tot 6 uur d urende voederinname inhibitie veroorzaakte, maar niet de totale dagelijk se voederinname kon remmen en dusdanig ook geen effect had op het lichaa msgewicht. Bovendien werd bij een dergelijke langdurige toediening hyperplasie in de pancreas vastgesteld en in sommige gevallen zelfs pan creatitis. Aangezien PEG-CCK9 elke dag opnieuw resulteerde in een voederinname remming en er dus geen tolerantie tegen PEG-CCK9 ontwikkeld werd, rezen vermoedens dat naast natuurlijke verzadigingseffecten ook a dversieve effecten konden bijdragen tot de geobserveerde anorexie. Intensieve studies zoals een geconditioneerde smaak aversie test, een a nalyse van de gedragssequentie geassocieerd met verzadiging en een grond ige analyse van het maaltijdpatroon, toonden aan dat de voederinname rem ming veroorzaakt door PEG-CCK9 vooral het resultaat is van het opwekken van een natuurlijk gevoel van verzadiging, alhoewel abnormale fysiologis che effecten zoals intestinale krampen eveneens kunnen bijdragen tot dez e voederinname remming, vooral bij dosissen vanaf 8µg kg-1. Verder e metabole studies toonden aan dat langdurige toediening geen effect had op de lichaamssamenstelling, noch op het metabolisme. Deze observ aties en het feit dat langdurige toediening schadelijk is voor de pancre as, doen twijfels rijzen over de toepassingsmogelijkheden van PEG-CCK9 i n de behandeling van obesitas. Desondanks, kan dit conjugaat mogel ijks gebruikt worden in andere klinische toepassingen. Tijdens experimenten met als doel de eigenschappen van PEG-CCK9 te achte rhalen, werden enkele opmerkelijke waarnemingen gedaan in de gepaard gev oederde (PF) dieren. Zo n groep van PF dieren wordt in een experim ent geïntroduceerd om na te gaan of de effecten die geobserveerd werden in de PEG-CCK9 behandelde dieren, afkomstig zijn van directe farmacologi sche acties van het conjugaat zelf of eerder afkomstig zijn van secondai re effecten door de verminderde voederinname. Ondanks het feit dat de PF ratten identiek dezelfde hoeveelheid voeder werd voorgeschoteld a ls geconsumeerd door de PEG-CCK9 behandelde dieren, vertoonden ze toch e en tragere groei. Metabole studies en DXA (dual-energy X-ray absor ptiometry) scans wezen uit dat de PF ratten een grotere vet/spier ratio vertoonden. Publicaties waarin gelijkaardige metabole verschuiving en aangetoond werden in dieren die gevoederd werden met een opgelegd voe derschema zonder nutriëntrestrictie (Armstrong et al. 1976; Bazotte et a l. 1989), hebben ons aangezet om na te gaan of de metabole observaties i n de PF ratten wel degelijk het resultaat waren van de afwezigheid van P EG-CCK9 injecties en niet eerder het resultaat waren van het onderliggen d opgelegd voederschema waarmee de dieren gepaard gevoederd werden. Voedselpatroonanalyses wezen uit dat het opgelegd voederschema van dri e porties per dag, resulteert in een compleet ander voedselpatroon waarb ij intermitterende perioden van voedseltekort voorkomen. Een vermi ndering van deze voedseltekort perioden resulteerde in een minder uitges proken metabole verandering. Dit bevestigt dat het opgelegd voeder schema in de PF ratten verantwoordelijk is voor het geobserveerde repart itioneringseffect. De secretie van ghreline, een orexigeen peptide dat adipogenese stimuleert, verhoogt tijdens vasten (Toshinai et al. 20 01). Ratten die behandeld werden met ghreline vertoonden een gelij kaardige vetafzetting als de PF ratten, wat suggereert dat de geobservee rde adipogenese in de PF ratten mogelijks afkomstig is van verhoogde ghr eline waarden. Inderdaad, uit verder onderzoek blijkt dat de ghrel ine waarden significant hoger waren in de PF dieren dan in de dieren met vrije toegang tot voeder. Bovendien vielen de ghreline pieken sam en met de exacte tijdstippen waarop de PF dieren hun gebruikelijke porti es kregen, wat suggereert dat ook anticipatorische processen een bijkome nde rol spelen in dit verschijnsel. In dit werk werd aangetoond dat PEG-CCK9 , via stimulatie van perifere C CK1-receptoren een verlengd anorexigeen effect heeft. Dit wekt een natuurlijk verzadigingseffect op en in mindere mate aversie. Desa lniettemin kan PEG-CCK9 niet gebruikt worden om obesitas te behandelen o mdat het geen effect op lichaamsgewicht of -samenstelling heeft en daare nboven nadelige effecten heeft op de pancreas. We toonden aan dat de verhoogde adipogenese in de PF dieren een gevolg i s van het opgelegd voederschema en het daaruit resulterende voederpatroo n met intermitterende perioden van voedseltekort. De verhoogde ghr eline waarden kunnen verklaard worden als een natuurlijk verdedigingsmec hanisme tegen mogelijks volgende perioden van energietekort. Ghrel ine informeert de hersenen namelijk over de negatieve nutritionele statu s van het lichaam en induceert vetafzetting in de plaats van groei.Dankwoord Samenvatting Summary List of publications List of abbreviations Table of contents Introduction and objectives 1 Chapter 1: State of the art 5 1.1 The regulation of the energy balance 7 1.1.1 Introduction 7 1.1.2 Peripheral signals 8 1.1.2.1 Short term signals 8 1.1.2.2 Long term signals 9 1.1.3 Central pathways for the control of the energy balance 12 1.2 Cholecystokinin 15 1.2.1 Introduction 15 1.2.2 Structure 15 1.2.3 Receptors 16 1.2.4 Release and functions 17 1.2.5 Cholecystokinin and food intake 23 1.2.6 Cholecystokinin in the regulation of the energy balance 27 1.3 PEGylation of cholecystokinin 29 1.3.1 Introduction 29 1.3.2 Concepts and definition 29 1.3.3 PEGylation of cholecystokinin9 32 1.3.3.1 Preparation and characterization of PEG-CCK9 32 1.3.3.2 Characteristics of PEG-CCK9 34 1.4 Ghrelin 35 1.4.1 Introduction 35 1.4.2 Structure 35 1.4.3 Receptors 37 1.4.4 Release and functions 37 1.4.5 Ghrelin and food intake 41 1.4.6 Ghrelin in the regulation of the energy balance 42 Chapter 2: Prolonged inhibitory effect of PEG-CCK9 on food intake: a dose-response study 45 2.1 Introduction 47 2.2 Materials and methods 47 2.3 Results 49 2.4 Discussion and conclusion 52 Chapter 3: Receptor involvement of the PEG-CCK9-induced anorectic effect 53 3.1 Introduction 55 3.2 Materials and methods 56 3.3 Results 59 3.3.1 Experiment 1: Effect of devazepide on PEG-CCK9-induced food intake inhibition 59 3.3.2 Experiment 2: Effect of 2-NAP on PEG-CCK9-induced food intake inhibition 59 3.4 Discussion and conclusion 61 Chapter 4: Lack of tolerance development with long term administration of PEG-CCK9 65 4.1 Introduction 67 4.2 Materials and methods 68 4.3 Results 70 4.3.1 Food intake analysis 70 4.3.2 Body weight change 73 4.3.3 Blood analysis 74 4.3.4 Pancreas analysis 76 4.4 Discussion and conclusion 78 Chapter 5: Evaluating aversive effects after PEG-CCK9 administration 85 5.1 Introduction 87 5.2 Conditioned taste aversion after PEG-CCK9 administration 88 5.2.1 Introduction 88 5.2.2 Materials and methods 89 5.2.3 Results 93 5.2.4 Discussion 96 5.3 Behavioral satiety sequence after PEG-CCK9 administration 99 5.3.1 Introduction 99 5.3.2 Materials and methods 99 5.3.3 Results 104 5.3.4 Discussion 110 5.4 Meal Pattern analysis after PEG-CCK9 administration 113 5.4.1 Introduction 113 5.4.2 Materials and methods 114 5.4.3 Results 119 5.4.4 Discussion 121 5.5 General discussion and conclusion 124 Chapter 6: Metabolic analysis 127 6.1 Introduction 129 6.2 Effect of PEG-CCK9 administration, pair-feeding and ghrelin administration on energy metabolism and whole body composition in juvenile rats. 131 6.2.1 Introduction 131 6.2.2 Materials and methods 131 6.2.3 Results 137 6.2.4 Discussion and conclusion 145 6.3 Effect of PEG-CCK9 administration, pair-feeding and ghrelin administration on spontaneous activity 151 6.3.1 Introduction 151 6.3.2 Materials and methods 152 6.3.3 Results 156 6.3.4 Discussion 157 Chapter 7: Impact of meal feeding: implication of ghrelin 159 7.1 Introduction 161 7.2 The effect of meal feeding on meal patterns 163 7.2.1 Introduction 163 7.2.2 Materials and Methods 163 7.2.3 Results 165 7.2.4 Discussion 169 7.3 Effect of meal feeding on body weight evolution and adipogenesis 172 7.3.1 Introduction 172 7.3.2 Materials and methods 172 7.3.3 Results 176 7.3.4. Discussion 179 7.4 Effect of meal feeding on circulating ghrelin and leptin levels 182 7.4.1 Introduction 182 7.4.2 Materials and methods 182 7.4.3 Results 184 7.4.5 Discussion 185 7.5 Effect of meal feeding on ghrelin secretion patterns 188 7.5.1 Introduction 188 7.5.2 Materials and methods 188 7.5.3 Results 192 7.5.4 Discussion 195 7.6 General discussion and conclusion 199 Chapter 8: Final discussion, conclusions and perspectives 201 8.1 PEG-CCK9 203 8.2 The impact of meal pattern 205 8.3 Perspectives 209 References 213nrpages: 237status: publishe