Development of an atmospheric pressure plasma for manufacture of bioactive films

Elk levend wezen en virus is opgebouwd uit een brede waaier van complexe chemische verbindingen of macromoleculen. De belangrijkste zijn zonder twijfel eiwitten waarbij elk type zijn eigen specifieke functie heeft in het organisme. Sommige leveren structuur en stevigheid, andere staan in voor de herkenningen van specifieke moleculen of het vertalen van inter ne of externe signalen. Enzymen zijn een uniek type van eiwitten en zijn actief in zowat elk biologisch en biochemisch proces. Ze zorgen ervoor dat de chemische reacties in een organisme op een correcte en snelle man ier worden uitgevoerd. Hun reactie specificiteit, milde reactie conditie s en stereoselectiviteit zijn unieke eigenschappen die een brede waaier aan toepassingen mogelijk maken. Gaande van massa productie van chemical iën tot ultra gevoelige sensoren. Daarenboven bieden nieuwe technieken z oals gene-shuffeling , eiwit modificatie, in-vitro of gesimuleerd e eiwit evolutie en het gebruik van extreem stabiele enzymen een nooit g eziene flexibiliteit om zowel de enzymen als de procesparameters op elka ar af te stemmen. Performantere onderzoekstechnieken en een multidiscipl inaire benadering leiden tot steeds meer toepassingen. Door de complexe natuur van eiwitten en enzymen is het wijzigen of engi neeren en de massaproductie ervan zo duur dat enzymen niet als verbr uiksgoederen kunnen aanzien worden. Om deze waardevolle biomoleculen te vrijwaren werden verschillende technieken ontwikkeld die hergebruik moge lijk maken bvb. door immobilisatie. Hoewel deze methoden eenvoudig toepa sbaar zijn in de meeste industriële processen zoals bioreactoren of waar devolle sensoren, blijven enkele hiaten onopgelost. De courant gebruikte meer-staps immobilisatiereacties beperken de snelle en eenvoudige produ ctie van biosensoren. Daarbij komt nog dat huidige, nat-chemische techni eken niet toepasbaar zijn op bvb. weefsels voor wondheling of kunststoff en die weekmakers bevatten. De ontwikkeling van een snelle immobilisatie techniek met een minimaal gebruik van solventen kan deze hiaten opvullen en nieuwe, voorheen onbereikbare toepassingen mogelijk maken. In dit onderzoek werd gekozen voor een coatingtechniek in de gasfase, nl . plasma enhanced chemical vapour deposition, bij atmosfeerdruk. De f lexibele reactiecondities, de verscheidenheid aan mogelijke substraten e n de relatief eenvoudige opschaling naar continue procesvoering bieden e en grote vrijheid om een succesvolle eiwit immobilisatiemethode te ontwi kkelen. Aangezien er geen literatuur beschikbaar is over de toepasbaarheid van d eze methode voor de immobilisatie van biomoleculen, werd dit onderzoek i n drie fasen ingedeeld. In een eerste fase werd een nieuwe reactor ontwo rpen die toelaat tegelijkertijd een oplossing van biomoleculen en een co ating precursor in de reactor te vernevelen. De reactor is operationeel bij zowel helium, lucht als stikstof onder atmosferische druk en kamerte mperatuur waarbij een brede waaier aan plasmareactiviteiten kan gescreen d worden. Daarnaast biedt de nieuw ontworpen vernevelaar de mogelijkheid om de plasma ontlading van een constante en regelbare toevoer van fijne eiwitdruppels te voorzien. Aangezien gewerkt zal worden met fragiele biomoleculen zijn milde plasma condities een vereiste. Daarom werden in een tweede fase verschillende c oating precursoren gescreend, op zoek naar deze die bij lage plasmareact iviteit nog een redelijke polymeriseerbaarheid en filmvorming vertonen. Van de meer dan 20 geteste precursoren werden pyrrool en acetyleen weerh ouden voor verdere immobilisatie-experimenten met enzymen en eiwitten. V ertrekkend van dit basis onderzoek werd uit een selectie aan biomolecule n gezocht naar de beste immobilisatiecondities. De keuze aan biomolecule n werd beperkt tot eiwitten en enzymen met een verscheidenheid aan stabi liteit, reactiviteit en functionaliteit. Een gedetailleerde lijst is ter ug te vinden in hoofdstuk II. De structurele integriteit van geïmmobilis eerd fluorescëine gelabelde bovine serum albumine, allophycocianine en h istidine gelabelde eiwitten kon met deze initiële experimenten worden aa ngetoond. Daarnaast kon ook de enzymactiviteit en een verhoogde solvent en temperatuur stabiliteit worden aangetoond respectievelijk voor glucos e oxydase, lipase en alkaline fosfatase. Dit onderzoek toont voor de eer ste keer de mogelijkheid aan om enzymen te immobiliseren in een snel, éé n staps proces terwijl het solvent gebruikt tot een minimum beperkt word t.PUBLICATIONS I TABLE OF CONTENTS III ABSTRACT VII SAMENVATTING IX LIST OF ABBREVIATIONS XI 1 GENERAL INTRODUCTION 1 1.1 BIOFUNCTIONAL COATINGS 1 1.1.1 Adsorption 1 1.1.2 Covalent binding 2 1.1.3 Affinity tags 4 1.1.4 Self assembled monolayer 5 1.1.5 Langmuir Blodgett/Schaefer films 6 1.2 ENTRAPMENT 6 1.2.1 Encapsulation 7 1.2.2 Sol-gel technology 7 1.2.3 Phase change materials 8 1.3 MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS 9 1.4 COMBINING DIFFERENT TECHNIQUES 9 1.5 ORIENTED IMMOBILIZATION 11 1.6 EFFECTS OF IMMOBILIZATION ON THE BIOMOLECULE 11 1.7 APPLICATIONS 12 1.7.1 Biocatalysis 12 1.7.2 Biomimetics 13 1.7.3 Biosensors and bioelectronics 14 1.7.4 The quest to the ideal link 14 1.8 STATE-OF THE ART PLASMA TECHNOLOGY 15 1.8.1 Different types of plasma 16 1.8.2 Reactor design 18 1.8.3 DBD discharge regimes 20 1.9 APPLICATIONS OF PLASMA TECHNOLOGY 23 1.9.1 Cold plasma DBD discharges, a versatile reaction environment 25 1.9.2 Applications in bio-functional surfaces 31 1.9.3 Medical applications 31 1.10 BIOMOLECULE IMMOBILIZATION 32 1.11 CONCLUSIONS 32 2 REACTOR DESIGN AND MODEL ENZYME SELECTION 35 2.1 REACTOR DESIGN AND OPERATIONAL WINDOW 35 2.1.1 Validation of the reactor 37 2.1.2 Power dissipation in atmospheric DBD reactors 40 2.1.3 Temperature control in DBD 41 2.2 CONTROLLABLE PROTEIN SUPPLY 42 2.3 MODEL ENZYME SELECTION 44 2.4 EXPERIMENTAL 47 2.4.1 Reactor setup 47 2.4.2 Estimation of useful power in the reactor 48 2.4.3 Temperature measurements 48 2.4.4 Particle size distribution 48 3 PRECURSOR SCREENING 51 3.1 INTRODUCTION 51 3.2 PLASMA POLYMERIZATION OF ORGANIC COMPOUNDS AT LOW PLASMA REACTIVITY 52 3.2.1 Physical properties of the acetylene and pyrrole coating 57 3.2.2 Chemical analysis of the acetylene and pyrrole coating 59 3.3 CONCLUSION 68 3.4 EXPERIMENTAL 69 3.4.1 Materials 69 3.4.2 Coating deposition 69 3.4.3 Materials characterization 70 4 PROTEIN IMMOBILIZATION USING ATMOSPHERIC PRESSURE DIELECTRIC BARRIER DISCHARGE 75 4.1 INTRODUCTION 75 4.2 PROTEIN IMMOBILIZATION IN PLASMA POLYMERS 76 4.2.1 Fluorescence microscopy of BSA-FITC proteins in plasma coatings 76 4.2.2 Immobilization of auto fluorescent proteins 78 4.3 CONCLUSION 80 4.4 EXPERIMENTAL 81 4.4.1 Reactor setup 81 4.4.2 Coating deposition and protein immobilization 81 4.4.3 Fluorescence imaging[338] 82 5 ENZYMES, PLASMAS AND POLYMERS, AN ELEGANT SYNERGY 87 5.1 INTRODUCTION 87 5.2 RESULTS AND DISCUSSION 89 5.2.1 Plasma assisted protein immobilization 89 5.2.2 Plasma assisted immobilization of glucose oxidase 92 5.2.3 Recognition of immobilized proteins 97 5.2.4 Solvent and thermal stability of enzymes immobilized in plasma polymerized coatings 98 5.3 CONCLUSIONS 102 5.4 EXPERIMENTAL 102 5.4.1 Reactor setup 102 5.4.2 Coating deposition 102 5.4.3 Single molecule measurements fluorescence microscopy 103 5.4.4 Computational fluid dynamic calculations 103 5.4.5 Activity measurements 103 5.4.5.1 GLUCOSE OXIDASE 103 5.4.5.2 ALKALINE PHOSPHATASE 104 5.4.5.3 LIPASE 105 6 CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES 109 6.1 AN INNOVATIVE CONCEPT 109 6.2 FUTURE PROSPECTS 110 7 APPENDIX: OPTIMIZATION, REUSABILITY AND UP-SCALING OPPORTUNITIES 113 7.1 INFLUENCE OF POWER DISSIPATION ON RETAINED ENZYME ACTIVITY 117 7.3 REUSABILITY OF THE COATINGS OBTAINED 121 7.4 EXEMPLARY SEMI-INDUSTRIAL COATING DEVICE 124 8 CITED REFERENCES 129nrpages: 149status: publishe