Inflammation-mediated neuronal dysfunction in the upper gastrointestinal tract

De neuronale controle van de gastrointestinale activiteit hangt af van de complexe intrinsieke bezenuwing door het enterisch zenuwstelsel en de beïnvloeding ervan door het ortho- en parasympatisch zenuwstelsel. Echter, wanneer dit netwerk fysisch of functioneel wordt onderbroken, dan ontstaan er allerhande pathologieën met hun geassocieerde symptomen. Patiënten die lijden aan gastro-enteritis of aan een opstoot van inflammatoire darmziekten melden dikwijls een slappe stoelgang, pijn en krampen. Dit wijst naar de ingrijpende gevolgen van ontsteking op de controle van de normale gastrointestinale fysiologie. Diermodellen en in vitro-onderzoek droegen bij tot het ontrafelen van de mechanismen betrokken bij de fysiologische afwijkingen die werden vastgesteld gedurende de inflammatoire aantasting van de lagere gastrointestinale tractus. In vitro-onderzoek wees erop dat pro-inflammatoire cytokines, en meer bepaald IL-1ß, in staat waren om een welbepaalde groep neuronen van het enterisch zenuwstelsel rechtstreeks en dosisafhankelijk te activeren. Voorbeelden hiervan zijn de neuronen die nNOS en ChAT uitdrukken. Daarenboven verhoogde de verlengde blootstelling aan IL-1ß de expressie van substantie P en inhibeerde het de vrijzetting van norepinefrine. Van recentere datum is de vaststelling dat dit cytokine in staat was om het antwoord van neuronen op bradykinine onrechtstreeks te verhogen. Dit werd aangetoond via co-culturen van neuronen en gliacellen. In de rectale mucosa van patiënten die lijden aan het irritable bowel syndroom (IBS) werden verhoogde spiegels van IL-1ß waargenomen. Dit was ook het geval in patiënten die lijden aan inflammatoire darmziekten. Bovendien was de secretie van dit cytokine toegenomen in periferebloed mononucleaire cellen (PBMC) van IBS patiënten die een post-infectieuze etiologie van hun klachten aangaven. Op basis van deze vaststellingen stelden we de hypothese voorop dat een verlengde blootstelling aan IL-1ß de neuronale werking na elektrische stimulatie of na superfusie van verschillende agonisten kan beïnvloeden. Aangezien dergelijk onderzoek de gelijktijdige monitoring van de neuronale activiteit van een groep neuronen vereist, werd gebruik gemaakt van calcium-imagingtechnieken voor de experimenten. In een eerste reeks experimenten toonden we aan dat deze techniek geschikt is voor de monitoring van de neuronale activiteit tijdens superfusie van IL-1ß. Aangezien het neuronaal antwoord niet beïnvloed werd door de aanwezigheid van tetrodotoxine, bewezen we dat dit antwoord onafhankelijk was van neuronale geleiding. Echter, extracellulair calcium was wel belangrijk daar het neuronaal antwoord bijna afwezig was bij afwezigheid ervan. In een volgende reeks experimenten verhoogde de voorafgaande incubatie in aanwezigheid van IL-1ß het neuronaal antwoord op serotonine op dosisafhankelijke wijze. Bijkomende experimenten waarbij paroxetine zowel tijdens de incubatie als tijdens superfusie van serotonine aanwezig was, toonden aan dat een verhoogde receptorsensitiviteit of een verminderde activiteit van SERT aan de basis kunnen liggen van het antwoord na incubatie met IL-1ß. Een klokvormig dosisafhankelijk antwoord werd ook vastgesteld na orale, aborale en laterale elektrische stimulatie van de integanglionaire vezels, alsook na superfusie van ATP. Het antwoord op substantie P werd echter niet beïnvloed. Op basis van elektrofysiologische, immuunhistochemische en retrograde labeling werd een gepolarizeerd model van neuronale controle van de intestinale reflexen gesuggereerd. In deze studie antwoordden echter een gelijkaardig percentage neuronen op orale als aborale elektrische stimulatie tijdens controle omstandigheden als na blootstelling aan IL-1ß. Dit suggereert dat dit cytokine de neuronale polarizatie niet bevordert. De vergaande effecten van verlengde inflammatie op de werking van enterische neuronen werden uitgebreid aangetoond in diermodellen van inflammatoire darmziekten, en in het bijzonder in colitis uitgelokt door TNBS. Verschillende afwijkingen werden aangetoond door immuunhistochemische en biochemische methodes alsook door spiercontractiestudies. Vooral de nitrerge dysfunctie verdient bijzondere aandacht. In vitrostudies en proefdieronderzoek wezen erop dat stikstofoxide op zich betrokken kon zijn in het verlies van neuronen die nNOS uitdrukken. Een gelijkaardig verlies van nitrerge neuronen werd ook beschreven in het maagdarmstelsel van zowel diabetische dieren als diabetische patiënten. Dit werd echter toegeschreven aan de nefaste effecten van een langdurige onvoldoende gecontroleerde glycemie. Aangezien inflammatoire aandoeningen ook de bovenste gastrointestinale tractus kunnen aantasten, wensten we de rol van inflammatie op afwijkingen in de neurotransmittorwerkingzoals beschreven bij diabetes te bestuderen. In verschillende diermodellen voor diabetes werd inderdaad een verlies van de nitrerge functie aangetoond door ondermeer immuunhistochemie, Western Blot, PCR spiercontractiestudies en door meting van de aanmaak van stikstofoxide. Algemener gesteld werden in deze modellen een verminderde expressie van inhibitorische neurotransmittoren en een toegenomen aanmaak van excitatorische neurotransmittoren vastgesteld. Eén van deze modellen, meer bepaald het BioBreeding ratmodel, heeft zijn nut bewezen in het onderzoek naar genen die voorbeschikken tot en in de mechanismen die leidentot het ontstaan van type 1 diabetes. In dit model ontwikkelen 20 to 80 % van de diabetes prone dieren spontaan hyperglycemie rond een leeftijd van 3 maanden (BBDP-H). Om de effecten van hyperglycemie te bestuderen worden deze dieren standaard vergeleken met leeftijd- en geslachtsgematchte diabetes resistente dieren (BBDR), die zonder specifieke interventie geen diabetes ontwikkelen. Voorgaande studies van onze groep wezen er al op dat inflammatie van het jejunum in de hyperglycemische dieren het meest uitgesproken was rond na 8 weken hyperglycemie. In dit onderzoek voegden we een derde groep leeftijds- en geslachtsgematchte ratten bij dieeigenlijk bestond uit de BBDP ratten die normoglycemisch bleven gedurende de volledige studie (BBDP-N). De experimenten werden 16 weken na het ontstaan van hyperglycemie in de BBDP-H groep uitgevoerd. We bevestigden voorgaande beschrijvingen van nitrerg verlies in de BBDP-H met Western Blot en ook met realtime RT-PCR. Daarenboven werd een gelijkaardig verlies vastgesteld in de BBDP-N groep. In daaropvolgende experimenten werd een hogere concentratie aan myeloperoxidase gemeten in BBDP in vergelijking met BBDR ratten. Ondanks het feit dat post-hoc testen erop wezen dat deze toename van inflammatiemerkers enkel significant was voor de BBDP-N in vergelijking met de BBDR, en gelet op de vroegere vaststelling dat inflammatie het meest uitgesproken was na 8 weken hyperglycemie, stellen we de hypothese voorop dat inflammatie, eerder dan hyperglycemie een rol speelt in de nitrerge dysfunctie. Daarnaast stelden we een verhoogde genexpressie van iNOS vast in BBDP ratten met realtime RT-PCR en dit was opnieuw onafhankelijk van de glycemie. Dit suggereert een rol voor het stikstofoxide aangemaakt door inflammatoire cellen in het verlies van de nitrerge functie. Daaropvolgende experimenten wezen ook op een toegenomen expressie van tryptofaan hydroxylase-1 en tyrosine hydroxylase, snelheidsbepalende enzymes in de aanmaak van respectievelijk de neurotransmittoren serotonine en noradrenaline, en een verminderde expressie van de neurotransmittor VIP in BBDP ratten, en dit hoofdzakelijk in de normoglycemische dieren. Andere auteurs wezen op de teloorgang van het newerk van interstitiële cellen van Cajal (ICC) in de darmen van diabetische dieren en ook bij mensen. Recenter werd een beschermende rol toegekend aan heme oxygenase-1 (HO-1) bij de vrijwaring van de expressie van c-KIT en de overleving van ICC. Ondanks het feit dat de expressie van c-KIT and HO-1 sterk gecorreleerd was, gebeurde dit onafhankelijk van de glycemie en de groep waartoe de ratten behoorden. Op basis van deze bevindingen postuleren we dat inflammatie eerder dan een verhoogde glycemie verantwoordelijk is voor de neuronale dysfunctie die wordt waargenomen in het Biobreeding rattenmodel, eventueel via de pathofysiologische tussenkomst van het door iNOS geproduceerde stikstofoxide. Het verlies van ICC kan te wijten zijn aan een ander mechanisme, waarbij het niet is uitgesloten dat HO-1 een rol speelt. Voorgaande experimenten wijzen erop dat zowel cellulaire als humorale inflammatoire veranderingen de normale werking van enterische neuronen in de bovenste maagdarmtractus kan verstoren. Inderdaad, discrete immunologische wijzigingen werden beschreven bij IBS patiënten, in het bijzonder wanneer een post-infectieuze oorsprong werd vermoed. Voorbeelden hiervan zijn een toename in het aantal mastcellen, polymorfonucleairen en intra-eptheliale lymfocyten, of ook nog de genotypische verschillen in cytokineproduktie, de toegenomen secretie van IL-1ß door ongestimuleerde PBMC en de toegenomen hoeveelheid IL-1ß in rectale biopsies. Evidentie in functionele dyspepsie daarentegen, ontbreekt grotendeels. Daarom onderzochten we duodenale biopsies van gevallen van zowel vermoedelijk post-infectieus ontstane functionele dyspepsie (PI-FD) patiënten alsook van FD patiënten met ongespecifieerd ontstaan (U-FD). Hierbij troffen we een toegenomen frequentie van focale aggregaten van T-cellen, en in het bijzonder CD8+ cellen, aan in PI-FD. Patiënten met deze afwijkingen vertoonden ook een significant vertraagde maagontlediging. Verder was het aantal CD4+ cellen rond de crypten verminderd, terwijl er juist meer macrofagen werden geteld. Dit kan wijzen op de relatieve inefficiëntie van het immuunsysteem om de immuunrespons te onderdrukken ondanks de verwijdering van het verantwoordelijk antigen. Los van deze veranderingen op cellulair vlak vergeleken we ook de gestimuleerde en ongestimuleerde aanmaak van cytokines door geïsoleerde PBMC en monocyten tussen enerzijds gezonde vrijwilligers en FD, IBS en non-cardiac chest pain (NCCP) patiënten, en anderzijds tussen patiënten met een vermoedelijk post-infectieuze oorsprong van hun aandoening en de overige patiënten. De prevalentie van allergieën was vergelijkbaar tussen de groepen. Wel bleek de gestimuleerde lymfocytaire expressie van IL-5 en IL-13 significant toegenomen, terwijl de produktie van IFN-γ en IL-10 verminderd was. In deze groep bleek ook de gestimuleerde monocytaire aanmaak van IL-12 verminderd. Wanneer post-infectieuze patiënten werden onderzocht, troffen we een verhoogde spiegel van serum IL-10. Bovendien was de aanmaak van THF-α verhoogd in deze groep. Verdere analyse wees op een sterke correlatie tussen Th1 en Th2-type cytokines. Er werden geen majeure immuunfenotypische veranderingen aangetroffen. Ondanks het feit dat inflammatie en inflammatoire mediatoren betrokken kunnen zijn in deetiopathogenese van FD zelfs na het sucesvol verwijderen van de uitlokkende factor, blijft het onduidelijk hoelang symptomen van FD aanslepen en welke factoren geassocieerd zijn met deze evolutie. Aan de hand van onze follow-up gegevens observeerden we dat 66.8% van de patiënten symptomatisch bleven na een gemiddelde follow-up periode van 68±2 maanden. Dit wijst op het ingrijpend karakter van deze aandoening. Een lager lichaamsgewicht en meer uitgesproken gewichtsverlies bij de eerste presentatie, maar vooral een hogere voorbeschiktheid tot angstig reageren op een gegeven situatie waren geassocieerd met aanhoudende symptomen van FD. Ook noteerden we een lagere levenskwaliteit en hogere scores op vragenlijsten naar depressie en angst bij deze patiënten. Dit wijst uiteraard op de belangrijke impact die deze aandoening heeft op het dagelijkse leven. Gelijkaardige resultaten werden verkregen in de subgroep van PI-FD. Daar een gemeenschappelijke pathway voorgesteld werd voor de verschillende functionelegastrointestinale aandoeningen (FGID), onderzochten we of patiënten die oorspronkelijk gediagnosticeerd werden als FD, andere FGID, zoals IBS of heartburn zouden ontwikkelen tijdens de follow-up. We ontdekten zo dat 9.1% van de patiënten die negatief waren geworden voor FD IBS- of heartburn-klachten vertoonden. Van de 66.8% die nog steeds aan de FD criteria beantwoordden, hadden 38.8% tegelijk klachten van IBS of heartburn. 14.0% leed zelfs aan de drie aandoeningen. Slechts 24.8% van de patiënten leek bij follow-up vrij van alle onderzochte FGIDs. Net zoals bij FD vertoonden IBS en heartburn-patiënten een verminderde levenskwaliteit, en ook hogere depressie- en angstscores. Ze waren bovendien meer geneigd een dieet te volgen of medicatie te nemen voor hun aandoening, en hun initieel gewichtsverlies was belangrijker. Tenslotte wees univariaat analyse in heartburn patiënten uit dat een slechtere evolutie gerelateerd was aan een tragere maagontlediging en een kleinere gestalte. Multivariaat onderzoek, echter, wees de slechtere evolutie enkel en alleen toe aan de FD status bij follow-up. Dit wijst er allemaal op dat FGIDs sterk gerelateerd zijn aan elkaar en een gemeenschappelijke pathway kunnen delen, mogelijks via post-inflammatoire veranderingen van het enterisch zenuwstelsel.status: publishe