Didanosine: Impurity Profiling and Active Anabolite Analysis by Capillary Electrophoresis

Didanosine (ddI, 2′,3′-dideoxyinosine) is een synthetische purine nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NRTI) van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV). Het kan gesynthetiseerd worden via deoxygenering van 2′-deoxynucleosiden of vanuit intacte nucleosiden gebruik makend van verschillende stappen, waaronder deoxygenering tot 2′,3′-onverzadigde deoxynucleosiden, die vervolgens worden gehydrogeneerd. Het kan ook enzymatisch worden bereid door deaminering van 2′,3′-dideoxyadenosine. Als onzuiverheden treft men in ddI vaak de uitgangsproducten van de synthese aan, alsook nevenproducten. Zoals alle NRTIs, is ddI een dideoxynucleoside analoog en als dusdanig een inactieve pro-drug. Het ondergaat intracellulaire fosforylering tot drie inactieve gefosforyleerde producten 2¢,3¢-dideoxyinosine-5¢-monofosfaat (ddIMP), 2¢,3¢-dideoxyadenosine-5¢-monofosfaat (ddAMP) en 2¢,3¢-dideoxyadenosine-5¢-difosfaat (ddADP) en tot het actieve metaboliet 2¢,3¢-dideoxyadenosinetrifosfaat (ddATP). ddATP remt de vermenigvuldiging van HIV door inhibitie van het HIV reverse transcriptase. Nu blijkt dat de intracellulaire concentratie aan actieve metaboliet in cellen een veel betere indicatie geeft van de therapeutische efficiëntie dan de plasmaconcentratie van de precursor. De intracellulaire ddATP concentratie is niet gecorreleerd met ddI gehaltes gemeten in het plasma, zodat het aangewezen is ddATP intracellulair te bepalen. En aangezien de intracellulaire concentratie aan ddATP bepalend is voor het welslagen van anti-HIV therapie, is het zeer belangrijk te beschikken over goede analytische technieken om het trifosfaat metaboliet te meten.Capillaire elektroforese (CE) wordt nog steeds verder ontwikkeld als analytische techniek met toepasbaarheid in allerhande gebieden. In deze studie werd CE toegepast voor de analyse van bulk ddI en voor de bepaling van het actieve anaboliet van ddI. Voor de analyse van de onzuiverheden in ddI werd gebruik gemaakt van micellaire elektrokinetische capillaire chromatografie (MEKC), dat in tegenstelling tot capillaire zone elektroforese (CZE) wel in staat was om ddI te scheiden van zijn verwante verbindingen. Met behulp van de anionische oppervlakteactieve verbinding, lithium dodecylsulfaat (LiDS) als pseudostationaire fase en natriumtetraboraat buffer als waterige fase kon didanosine gescheiden worden van 13 potentiële onzuiverheden in 20 min, hetgeen veel sneller is dan met vloeistofchromatografie. De optimalisatie van de methode en het robuustheidsonderzoek werden uitgevoerd met behulp van experimenteel design. De methode was selectief, herhaalbaar, lineair, robuust en gevoelig, en was dus geschikt voor de analyse van ddI. Drie commerciële didanosine monsters werden geanalyseerd en vier onbekende onzuiverheden werden gedetecteerd. De identiteit van deze onzuiverheden moet nog verder opgehelderd worden.Voor de bepaling van de actieve anaboliet van ddI werd initieel een CZE-UV methode ontwikkeld die in staat was ddATP te scheiden van de andere metabolieten en van endogene nucleotiden bij vrij hoge concentraties (20 200 µg/mL) die UV detectie toelaten. Om de gevoeligheid op te drijven werd gedacht aan fluorescentie detectie met voorafgaande derivatizering van de verbindingen. Het molecule werd gederivatizeerd op twee plaatsen nl. de fosfaatgroep en de adenine base. Derivatizering van ddATP via de fosfaatgroep in aanwezigheid van N-(3-dimethylaminopropyl)-N¢-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDAC) met dansylethyleendiamine (dansyl EDA) was sneller dan met 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceen-3-propionylethyleendiamine (BODIPY FL EDA). De reactieomstandigheden, concentraties aan reagentia en de detectieparameters werden geoptimaliseerd en de beste derivatizering werd bekomen in een 0.1 M 1-methylimidazool buffer (pH 8.0) met 140 mM EDAC in 1-methylimidazool buffer en 30 mM dansyl EDA in DMF gedurende 90 min bij 60°C. De dansyl EDA derivaten van ddATP, 2¢-deoxyadenosine-5¢-trifosfaat (dATP) en ATP comigreerden echter met de CZE-fluo methode; daarom werd een MEKC-fluo methode ontwikkeld en geoptimaliseerd om herhaalbare scheidingen te bekomen. Na dansylering was de gevoeligheid voor detectie van ddATP met MEKC-fluo detectie (LOQ = 12 ng/mL) 160 maal hoger dan met CZE-UV detectie (LOQ = 1.9 µg/mL) en beter dan met een beschreven CE-MS methode (LOQ = 50 ng/mL). Deze winst in gevoeligheid laat echter nog geen bepaling van intracellulaire fmol concentraties aan ddATP toe.Derivatizering via de adenine base van ddATP werd ook onderzocht. Verschillende fluoroforen zoals chlooraceetaldehyde, 9-fluorenylmethyloxycarbonylchloride (FMOC), fluorescamine (Fluram), o-ftaaldialdehyde (OPA) en complexatie met terbium (Tb), gadolinium (Gd) and fenantroline (phen) werden uitgeprobeerd. Derivatizering met chlooraceetaldehyde gaf een slechte piekvorm voor het ε-ddATP adduct en degradatie tot ε-adenine, wat wellicht te wijten was aan de lage pH van het monster. Derivatizering van ddATP met OPA / ß-mercaptoethanol, Fluram en FMOC resulteerde niet in fluorescerende producten. Complexatie van ddATP met Tb-Gd-phen gaf een scherpe fluorescerende piek. De gevoeligheid van detectie van het Tb-Gd-ddATP-phen complex was 20 maal hoger dan UV detectie van ddATP, maar minder gevoelig dan dansyl EDA derivatizering van ddATP. Derivatizering van ddATP via de adenine base is niet te verkiezen, en een grote factor hierin is het feit dat men geen pH lager dan 7.0 kan gebruiken wegens de zuur labiliteit van ddATP.Voor verder werk werd dan ook gekozen voor de dansylering van ddATP via de fosfaatgroep. Er werd getracht de gevoeligheid bijkomend op te drijven door de derivatizering te combineren met on-line capillaire focusseringsmethoden gebaseerd op elektroforetische effecten zoals transient isotachoforese (tITP) en field-amplified sample stacking (FASS). Voor tITP werden geschikte leading en terminating elektrolyten gezocht door hun mobiliteit te bepalen aan de hand van indirecte fluorescentie detectie. Al de uitgeteste focusseringsmethoden werden sterk gehinderd door de overmaat aan derivatizeringsreagens aanwezig in het monster. Large-volume sample stacking (LVSS) met DETA als EOF onderdrukkend agens (ES) gaf de beste resultaten. In combinatie met CZE-UV was het zelfs mogelijk om niet gederivatizeerd ddATP waar te nemen bij 160 maal lagere concentraties dan bij de conventionele CZE-UV detectie zonder stacking. Het hier gebruikte vluchtige systeem zou kunnen gekoppeld worden met MS om de gevoeligheid nog te verbeteren. Een aantal andere effecten (miscellaneous effects) lieten ook toe om met fluorescentie detectie een lagere LOQ = 125 fmol/monster te bereiken (50 maal beter dan voorheen met MEKC-fluo). Preliminaire studies met "peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) toonden een goede scheiding van het dansyl EDA derivaat van ddATP en de endogene stoffen aanwezig in het cellysaat. Derivatizering van ddATP in een lager volume en dus een hogere concentratie verbeterde de gevoeligheid (LOQ = 10 fmol/monster) 12,5 maal in vergelijking met de miscellaneous effects, zodat het mogelijk was te analyseren op fmol niveau. De selectiviteit en herhaalbaarheid van de MEKC-fluo methode moeten nog verder worden geoptimaliseerd voor toepassing in PBMCs.status: publishe