Pathophysiology and prevention of adhesion formation in a laparoscopic mouse model

Intraperitoneale adhesies zijn abnormale fibreuze strengen tussen oppervlakten in de abdominale caviteit ten gevolge van voorgaande chirurgische ingrepen. Klinisch vormen ze een groot probleem daar ze aanleiding kunnen geven tot chronische pijn, intestinale obstructie, vrouwelijke infertiliteit en complicaties bij re-operaties.Ten gevolge van een chirurgische ingreep ontstaat een trauma in het peritoneum, wat aanleiding geeft tot een inflammatoire reactie met vorming van een fibrine beslag. In dit fibreus exudaat, migreren verschillende types cellen, ze prolifereren en/of differentiëren en geven aanleiding tot moleculen die leidentot ofwel een normale heling of adhesie formatie. De balans tussen fibrine depositie en degradatie is hierin kritisch. Wanneer fibrine volledig gedegradeerd wordt, zal een normale peritoneale heling ontstaan, daarentegen, als fibrine niet volledig degradeert, zal dit aanleiding geven tot een platform voor fibroblasten en capillaire ingroei. Deze fibroblasten zullen invaderen in deze matrix and extracellulaire matrix (ECM) wordt geproduceerd en neergeslagen. ECM wordt normaal volledig gedegradeerd door matrixmetalloproteïnasen (MMPS), wat aanleiding geeft tot een normale heling. Als dit proces echter wordtgeïnhibeerd door TIMP s, zullen peritoneale adhesies worden gevormd.Hierbij is ook de ernst van het trauma van belang in het ontwikkelen van adhesies. Ondanks dat een laparoscopische procedure minder trauma veroorzaakt dan een laparotomie, veronderstelden we dat het pneumoperitoneum gebruikt tijdens een laparoscopie eveneens een nadelig effect heeft. In voorgaande studies toonden we aan dat een CO2 pneumoperitoneum aanleiding geeft tot meer adhesies op een tijds- en druk dependente manier en dat deze toename kan gereduceerd worden door de additie van 3-4% zuurstof aan het pneumoperitoneum. Dit suggereert een peritoneale hypoxie als drijvende kracht in dit mechanisme.Tijdens deze thesis, toonden we aan dat het pneumoperitoneum kan aanleiding geven tot anderetrauma nl desiccatie en we verduidelijken de complexe relatie tussen afkoeling en desiccatie. Desiccatie leidt tot een toename van adhesies en dit wordt meestal onderschat doordat de geassocieerde koeling leidt tot een vermindering in adhesie vorming. In deze thesis bevestigen we het effect van hypothermie ophet verminderen van adhesies, een effect dat bij 32°C kwantitatief te vergelijken is met humidificatie. De initiële hypothese dat oversaturatie van het geïnsuffleerde gas een voordelig effect zou hebben op adhesie vorming, doordat alle desiccatie zou vermeden worden, blijkt dus fout te zijn. Dit is het gevolg van de geassocieerde stijging in peritoneale temperatuur en enthalpie van het gas. Uit deze data vermoeden we dan ook dat insufflators die het gas opwarmen tot lichaamstemperatuur zonder bevochtiging een meer nadelig effect zouden hebben op adhesie vorming dan insufflators zonder opwarming ten gevolge van hogere temperaturen en desiccatie. Deze data moeten echter geconfirmeerd worden in humane studies, bij wie een daling in de temperatuur van het pneumoperitoneum niet noodzakelijk geassocieerd is met een daling van de lichaamstemperatuur. Doch indien deze gegevens bevestigd worden in humane studies, heeft dit een belangrijk klinisch impact. Dit betekent immers dat insufflators en bevochtigers zodanig moeten ontwikkeld worden dat trauma ten gevolge van het pneumoperitoneum geminimaliseerd wordt waardoor er minder postoperatieve adhesies zullen ontstaan.We suggereren dat het insufflatie gas kan geoptimaliseerd worden om zo de hypoxie en de dessicatie te verminderen en aldus adhesie vorming te beperken. Hiervoor moet het gas bevochtigd worden en moet 3-4% zuurstof aan het CO2 worden toegevoegd. Bovendien is afkoeling van de peritoneale holte belangrijk gezien dit zowel het effect van de hypoxie als van de dessicatie doet afnemen doordat cellen bij lagere temperatuur meer resistent worden aan metabole schade.In combinatie hiermee stellen we voor agentia te gebruiken die inwerken op de verschillende mechanismen van adhesie vorming zijnde inflammatie (anti-inflammatoire medicatie als dexamethasone, calcium kanaal blokkers als diltiem), ischemie-reperfusie (ROS scavengers zoals SOD en ascorbine zuur), fibrinolyse (Reteplase) en barriers (Hyalobarrier Gel, Spraygel, phospholipiden). Deze resultaten zijn veelbelovend aangezien we enkel en alleen al door gebruik van een geoptimaliseerd insufflatie gas adhesie vorming met 48% kunnen verminderen. Door toevoeging van andere agentia kan deze vermindering verhoogd worden tot 76-90%. Natuurlijk moeten nieuwe molecules en combinaties van agentia getest worden en bevestigd worden in klinische trials.TABLE OF CONTENTS Chapter 1: Introduction 1 1.1 Definition, aetiology and incidence of intraperitoneal adhesions 1 1.2 Clinical significant of intraperitoneal adhesions 2 1.3 Pathophysiology of intraperitoneal adhesions 2 1.4 Postoperative adhesions: laparoscopy vs. laparotomy 4 1.5 Laparoscopy and pneumoperitoneum 5 1.6 Pneumoperitoneum as a cofactor in adhesion formation 5 1.7 Adhesion prevention 6 1.7.1 Limitation or prevention of initial peritoneal injury 7 1.7.2 Prevention of coagulation and fibrin deposition 7 1.7.3 Removal or dissolution of deposited fibrin 7 1.7.4 Prevention of the adherence of surfaces of adjacent structures by keeping them apart 8 1.7.4.1 Mechanical barriers 9 1.7.4.2 Semisolid barriers 10 1.7.4.3 Liquid barriers or hydroflotation 11 1.7.4.4 Tissue precoating 12 1.7.4.5 Surfactant-like substances 12 1.7.5 Prevention of the organization of the persisting fibrin by means of inhibiting the fibroblastic proliferation. 13 1.7.6 Prevention of the angiogenesis 13 1.7.7 Prevention of the oxidative stress 13 1.7.8 Prevention of the hypoxia 14 1.7.9 Summary: adhesion prevention today 14 1.8 General aims of this thesis 15 Chapter 2: Results 17 2.1 Results of aim#1: Final standardization of the laparoscopic mouse model 17 2.1.1. Effect of mouse strain upon adhesion formation 17 2.1.2. Effect of environmental temperature, dry ventilation, desiccation and oversaturated insufflation gas upon mouse body temperature 18 2.1.3. Effect of temperature upon adhesion formation 23 2.1.4. Effect of desiccation upon adhesion formation 28 2.2. Results of aim#2: Screening of anti-adhesion products in our models 31 2.2.1. Screening of all the products which have been described to affect adhesions in a model with 60 min pure CO2 pneumoperitoneum, i.e., the hypoxia model 31 2.2.2. Screening of selected products which have been described to affect adhesions in a model with 60 min CO2 pneumoperitoneum +12% oxygen, i.e., the hyperoxia model 35 2.2.2.1. To confirm the hypothesis that hypothermia prevents adhesions by making cells more resistant to the toxic effects of the hyperoxia 35 2.2.2.2. To screen some of the products used in 2.2.1 in order to know their relative effectiveness also in the hyperoxia model 35 2.3. Results of aims #3 and #4: Screening of combination of treatments 37 2.3.1. To confirm the hypothesis that hypothermia prevents adhesions by making cells more resistant to hypoxia. 37 2.3.2. To screen some of the products used in the Section 2.2.1 in order to know their relative effectiveness also in the normoxia model and to combine with the low-temperature treatment. 37 2.3.3. To confirm that the addition of an extra trauma like bleeding increases adhesion formation 37 2.3.4. Establishment of which combination of treatments will give a maximum reduction of adhesions 39 Chapter 3: Discussion 41 3.1 Animal models to study adhesion formation 41 3.1.1 Existing models 41 3.1.2 The mouse model 42 3.1.3 Experimental factors which should be controlled and/or standardised to investigate adhesion formation 43 3.1.4 New conceps of pathophysiology that have been derived from the mouse model 45 3.1.4.1 Peritoneal hypoxia, normoxia and hyperoxia 45 3.1.4.2 Hypothemia decreases adhesions 47 3.1.4.3 Desiccation increases adhesion formation 50 3.1.4.4 Adhesion formation depends on the genetic background 52 3.2 Adhesion prevention 54 3.2.1 Prevention in the hypoxic model 54 3.2.2 Prevention in the hyperoxia model 59 3.2.3 Combination of treatments 62 3.3 Pathophysiology of adhesion formation 65 3.4 Future Aspects 67 3.5 Summary 68 3.6 Summary in Dutch 70 Chapter 4: Bibliografy 73 Addendum 87 Addendum 1: General methods and procedures 87 1.1 The laparoscopic mouse model 87 1.1.1 Animals 87 1.1.2 Anaesthesia and ventilation 87 1.1.3 Laparoscopic surgery 88 1.1.4 Induction of intraperitoneal adhesions 88 1.1.5 Scoring of adhesions 88 1.1.6 Our triple model 89 1.2 Set up and general design of the experiments 89 1.2.1 Environmental temperature 90 1.2.2 Body and pneumoperitoneum temperatures and pneumoperitoneum relative humidity 90 1.2.3 Pneumoperitoneum gas conditions: desiccation and humidification 91 1.3 Statistics 91 Addendum 2: Binda MM, Molinas CR, Koninckx PR. Reactive oxygen species and adhesion formation: Clinical implications in adhesion prevention. Human Reproduction 18 (12): 2503-2507, 2003. 95 Addendum 3: Molinas CR, Binda MM, Campo R, Koninckx PR. Adhesion formation and interanimal variability in a laparoscopic mouse model varies with strains. Fertility & Sterility 83(6):1871-4, 2005. 101 Addendum 4: Binda MM, Molinas C.R., Mailova K. and Koninckx P.R. Effect of temperature upon adhesion formation in a laparoscopic mouse model. Human Reproduction 19(11):2626-32, 2004. 107 Addendum 5: Binda MM, Molinas CR, Hansen P. and Koninckx PR. Effect of desiccation and temperature during laparoscopy on adhesion formation in mice Fertility & Sterility 86(1):166-175, 2006. 115 Addendum 6: Molinas CR, Binda MM and Koninckx PR. Angiogenic factors in peritoneal adhesion formation. Gynecological Surgery 3: 157-167, 2006. 127 Addendum 7: Binda MM, Molinas CR, Bastidas A. and Koninckx PR. Effect of reactive oxygen species scavengers and anti-inflammatory drugs upon CO2 pneumoperitoneum-enhanced adhesions in a laparoscopic mouse model. Surgical Endoscopy 21(10):1826-34, 2007. 139 Addendum 8: Binda MM, Molinas CR, Bastidas A, Jansen M and Koninckx PR. Efficacy of barriers and hypoxia inducible factor inhibitors to prevent CO2 pneumoperitoneum-enhanced adhesions in a laparoscopic mouse model. Journal of Minimally Invasive Gynecology 14(5):591-9, 2007. 149 Addendum 9: Binda MM and Koninckx PR. The role of the pneumoperitoneum in adhesion formation Adhesions News & Views 10: 11-13, 2007. 159 Addendum 10: Binda MM, Hellebrekers B, Declerck P, Koninckx PR. Effect of Reteplase and PAI-1 antibodies upon postoperative adhesion formation in a laparoscopic mouse model (submitted) 163 Addendum 11: Binda MM and Koninckx PR. Prevention of hyperoxia enhanced adhesions in a laparoscopic mouse model. 177 Addendum 12: Binda MM and Koninckx PR. Combination of treatments to prevent pneumoperitoneum enhanced adhesions in a laparoscopic mouse model. 179status: publishe