Etude du remodelage tumoral associé aux effets du peptide vasoactif urotensine II sur la néoangiogenèse et la croissance des glioblastomes

The mechanisms leading to new blood vessel formation is a prerequisite for adequate oxygenation and nutrient distribution in whole organism tissues. Starting during embryonic development, blood vessel formation results of the association of tubulogenic structures composed of endothelial cells, surrounded by smooth muscle cells and fibroblasts that stabilize the final network. The whole process is orchestrated by molecular factors, coordinating cell migration and orientation until adhesion at their final localization. These identified pro- and anti-angiogenic factors belong to growth factor and peptide families, and altogether tightly regulate the equilibrium of the angiogenic balance. In adults, such phenomenon occurs in physiological functions, such as menstrual cycles or vascular remodeling, and also in diseases like diabetes, age-related macular degeneration or cancer.Among cancers, particular subtypes are characterized by neo-angiogenic capacities, correlated with chemo resistance and aggressiveness. Deriving the normal preexisting vascular network for its own purpose, glial-derived brain tumors are highly proliferative and malignant neoplasms, incurable at this date. In particular, glioblastoma multiform (GBM) is a World Health Organization classified grade IV brain tumor, composed of pernicious infiltrative gliomal cells generating massive but diffuse tumor mass that literally crush normal brain vasculature, leading to necrotic foci and edema formation. Tumor cells are known to release pro-angiogenic molecules such as stromal-derived factor 1 (SDF-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF), in concentrations so high that the newly formed blood vessels appear aberrant, leaky and hemorrhagic. Consistent with the cerebral tissue sensibility for aneurisms and edema, this last point is a source of concern in the clinical management of this disease. The urotensinergic system is composed of two neuropeptides, urotensin II UII) and its paralog urotensin II-related peptide (URP) activating a class 1 GPCR called UT. Classically, this vasoactive system is involved in the cardiovascular parameters and tonic activity of blood vessels modulations. It has been demonstrated an up-regulation of UII and UT in multiple peripheral and central neoplasms. Recent work conducted in the research group “Astrocyte and Vascular Niche”, coordinated with Dr Hélène Castel, demonstrated that UII neuropeptide is a potent chemokine involved in glioma development, presenting a dual profile i) induction of directional migration of gliomal cells in a gradient concentration and ii) promotion of cell adhesion in homogenous concentration. These characteristics, supplemented with numerous reports indicating a central role of UII in vascular remodeling, strongly suggest that urotensinergic system is implied in GBM tumorogenesis. The present PhD thesis work aims to characterize the ability of UT agonist and antagonist to modulate glioma development. Experiments conducted on human endothelial cells from central and peripheral origins as well as on glioma cells showed that UII stimulated directional migration in vitro. Tridimensional cultures of endothelial cells reproducing extracellular matrix interaction allowed the recreation of capillaries-like tubes. We identified that UII is the only urotensinergic ligand that can orchestrate tubular structures formation. Subcutaneous implantation of plugs enriched with UT ligands in C57/Bl6 mice, showed that human and murine UII are recruiting peptides for peripheral macrophages as well as smooth muscle and endothelial cells. Human glioblastoma cell line U87-MG, naturally expressing UT, were grafted in immunodepressed Swiss Nude mice. The subcutaneous formed neoplasms overexpressed UT and UII in the vascular and gliomal components. We then dissected the impact of a series of agonists (hUII, URP, UII4-11) and antagonists (palosuran, urantide) to modulate xenografts growth and animal survival. Our results first demonstrated that daily intra-tumoral injections of hUII can greatly accelerate tumorigenesis, correlated with weak survival. Blockage of UT with non peptidic antagonist palosuran, and in a more extent with peptidic antagonist/biased ligand urantide were both able to slow down GBM tumorigenesis. Histological features of such treated tumors were then analyzed. We showed that the natural ligand hUII enhanced mitotic index, supported by an intense densification of the tumoral vascular network, whereas UT antagonists, and urantide in particular, diminished tumor proliferation and intra-tumoral blood vessel formation. Paradoxically, the angiogenic balance described as equivalent concentrations of pro- and anti-angiogenic molecules in the neighborhood of growing blood vessels, was greatly perturbed by high doses of proangiogenic UII, and generated poorly functional and hemorrhagic capillaries, forminghypoxic necrotic areas within xenografts. Administered during long time periods, urantide also induced such necrosis, probably provoked by the insufficient tumor perfusion due to an inadequate angiogenesis.The development of theranostic tools to follow GBM growth in patients has been initiated in our research group, in collaboration with the LITIS laboratory (EA 4108, QuanTiF team, Pr Pierre Véra and Dr Pierre Bohn, Rouen, France). MicroSPECT imaging of αVβ3 integrins with a specific 99mTc-RGD probe have been validated in U87-MG xenografted Nude mice, treated either with hUII or urantide. We showed that in early tumoral growth, integrins were confined in newly forming blood vessels and can be a confident marker of GBM angiogenesis. After a prolonged development period, αVβ3 is also overexpressed in non necrotic gliomal cells, despite a lower global 99mTc-RGD capitation due to massive necrosis and weak probe diffusion by poorly functional blood vessels. Indeed, immunohistochemical staining of integrins in these tumors brought to the conclusion that UII and urantide can induce a massive switch of integrin expression in the entire tumor. While UII and urantide present divergent activities, integrin quantification and measurement of necrosis both suggest that urantide may act as a biased ligand. Altogether, our data participate to better understanding of GBM development biology, and identification of new candidates for therapeutic options. Use of biased synthetic ligands for multiple vasoactive systems could lead to better clinical management of this lethal disease.•La néoangiogenèse est un processus physiologique majeur permettant l’apport constant et adéquat en oxygène et nutriments à l’ensemble des tissus d’un organisme. Dès le développement embryonnaire, la vasculogenèse résulte de l’association des cellules endothéliales en tubes, capillaires puis réseau veineux dans un élégant ballet coordonné par un orchestre cellulaire et moléculaire. Des facteurs de croissance et des peptides définissent l’orientation des cellules, tantôt migrantes de manière directionnelle, tantôt adhésives pour renforcer la structure finale du vaisseau. Chez l’adulte, ce mécanisme intervient dans des phénomènes physiologiques, comme les cycles menstruels ou le remodelage vasculaire adaptatif au développement tissulaire, et physiopathologiques comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge, le diabète ou le cancer. Parmi les cancers, les plus agressifs et chimiorésistants sont ceux qui se caractérisent par une néoangiogenèse particulièrement complexe, dérivant du réseau vasculaire préexistant. C’est notamment le cas des tumeurs cérébrales d’origine gliale, constituées de cellules gliomales malignes, dont les cycles accélérés de mitoses consomment une énorme quantité d’énergie. Ecrasés par la masse tumorale grandissante et sous-dimensionnés pour une telle demande énergétique, les capillaires intracérébraux répondent aux signaux pro-angiogéniques libérés par les cellules cancéreuses, elles-mêmes activées par l’hypoxie progressive qu’elles subissent. Il s’agit du même orchestre de molécules impliquées dans la néoangiogenèse physiologique, comme le stromal-derived factor 1 (SDF-1) ou le vascular endothelial growth factor (VEGF), mais dont les fortes quantités libérées donne lieu à une interprétation qui s’éloigne de l’oeuvre originale, et in fine donne naissance à un réseau souvent chaotique, peu fonctionnel voire hémorragique. Au regard de la sensibilité du tissu cérébral aux anévrismes et/ou oedèmes, ce dernier point s’avère dramatique dans le cas de tumeurs centrales. Le système urotensinergique regroupe deux neuropeptides, l’urotensine II (UII) et son paralogue urotensin II-related peptide (URP), qui activent un RCPG de classe 1 dénommé UT. Classiquement impliqué dans la modulation de paramètres cardiovasculaires et/ou vasoactifs, il a récemment été décrit que ce système est surexprimé dans de nombreux néoplasmes périphériques et centraux. Des travaux menés dans l’équipe « Astrocytes et Niche Vasculaire » (dirigée par le Dr Hélène Castel), ont mis en évidence une nouvelle activité du peptide UII qui agit comme une puissante chimiokine dans le développement des gliomes, i) en induisant la migration directionnelle de cellules tumorales soumises à un gradient de concentration, ou ii) en stimulant leur adhésion lorsqu’elles sont traitées par une concentration homogène d’UII. Ces propriétés, complétées par les données de la littérature montrant que l’UII est impliquée dans le remodelage vasculaire, plaident en faveur d’un rôle central du système urotensinergique dans le développement des tumeurs cérébrales d’origine gliale. Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont pour objectif de déterminer l’implication du système urotensinergique dans les processus qui concourent au développement des gliomes malins. Par une approche expérimentale sur des cultures de cellules endothéliales humaines, nous avons testé différents ligands de l’UT, i. E. Agonistes naturels ou synthétiques et antagonistes. Nous montrons que seule l’UII est capable de stimuler la migration directionnelle et la formation de tubes endothéliaux. Dans un modèle de chimioattraction in vivo, l’UII entraîne le recrutement de populations cellulaires impliquées dans la formation de capillaires fonctionnels, a priori, à savoir des cellules endothéliales, musculaires lisses et des macrophages. Des cellules tumorales humaines U87-MG, greffées dans des souris immunodéprimées Nude, forment des tumeurs hétérotopiques, qui expriment l’UT aux niveaux vasculaire et tumoral, que nous avons soumises à des traitements par des agonistes (UII, URP, UII4-11) ou antagonistes (palosuran, urantide) de l’UT. L’administration d’UII provoque une accélération drastique de la tumorigenèse, associée à une médiane de survie significativement inférieure au groupe témoin. Le blocage de l’UT avec un antagoniste non peptidique, le palosuran, ou un antagoniste peptidique présentant les caractéristiques d’un ligand biaisé, l’urantide, retardent durablement la croissance tumorale. L’analyse histologique des tumeurs révèle que l’administration d’UII augmente l’index de prolifération des cellules tumorales, accompagnée d’une densification du réseau vasculaire intratumoral tandis que les antagonistes de l’UT, et a fortiori l’urantide, diminuent l’index prolifératif et bloquent l’angiogenèse. Paradoxalement, la balance angiogénique, qui repose sur un équilibre entre les concentrations de facteurs pro- et anti-angiogéniques au voisinage des vaisseaux en formation, est fortement perturbée par les doses d’UII pro-angiogénique et génère une angiotecture fortement altérée. En résulte un réseau de capillaire certes dense, mais peu fonctionnel et hémorragique, responsable de la formation de zones nécrosohypoxiques de plus en plus étendues. Administré sur une longue période, l’urantide induit également une nécrose tissulaire massive, par la diminution drastique du réseau vasculaire, devenant insuffisant pour alimenter le tissu tumoral. Afin de développer des outils théranostiques innovants pour suivre l’évolution des gliomes chez les patients, nous avons développé, en collaboration avec le Laboratoire LITIS (EA4108 équipe QuanTiF, Pr Pierre Véra et Dr Pierre Bohn, Rouen), un protocole d’imagerie singlephoton emission computed tomography (SPECT) à l’aide de sondes spécifiques des intégrines αVβ3 couplées à du technétium radioactif (99mTc-RGD), validé dans des souris Nude xénogreffées avec des cellules de gliomes humain U87-MG et traitées avec de l’UII ou de l’urantide. Nous avons montré qu’au début du développement tumoral, l’αVβ3 est essentiellement localisée dans l’endothélium vasculaire en croissance. L’intégrine est ensuite progressivement retrouvée dans l’ensemble des cellules tumorales. Au terme de nos expériences, la captation de la sonde diminue à mesure de l’apparition de la nécrose intragliomale et de la faible perfusion intratumorale par les néo-vaisseaux malformés. En accord avec cette cinétique, nous avons démontré par immunohistochimie que l’UII et d’une manière surprenante l’urantide, induisent une surexpression d’αV suggérant fortement que l’urantide agirait comme un ligand biaisé. L’ensemble de ces données participe à la compréhension des mécanismes tumorigéniques dans les gliomes malins et à l’identification de nouveaux facteurs. Les systèmes de peptides vasoactifs, de nouveaux candidats identifiés, semblent être des éléments cruciaux impliqués dans la régulation des processus de néoangiogenèse, hypoxie et nécrose, caractéristiques des tumeurs centrales et périphériques de haut grade