Aspectos bioquímicos-estruturais do transportador de nucleotídeos de adenina, cardiolipinas e ciclofilina D na Transição de Permeabilidade Mitocondrial

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Doutor Ciências Área de Concentração: Toxicologia Orientado: Cezar Rangel Pestana Orientador: Prof. Dr. Carlos CurtiA oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys 56 ) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico- estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys 56 , como resultado da interação preferencial do Ca 2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro 61 ) potencializou o efeito induzido por Ca 2+ . A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys 56 promovida pelo Ca 2+ , enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro 61 , de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca 2+ na mobilidade relativa do ANT-cys 56 , de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca 2+ induz a conformação “c” do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação “c” do ANT induzida por Ca 2+ , sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca 2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado “c”, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT- pro 61 , com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys 56 parcialmente sensível ao ADPOxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT- cys 56 ) is potentially involved in Ca 2+ -induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca 2+ -induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca 2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys 56 relative mobility while ANT-pro 61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca 2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca 2+ induces conformation “c” of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca 2+ -induced ANT conformation “c”, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca 2+ -induced PTP opening involves ANT conformation “c” change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro 61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys 56 , in a ADP- sensitive manne