Identifizierung und Charakterisierung der Enzyme der Acetatbildung und der Acetataktivierung in halophilen und hyperthermophilen Archaea : ADP-bildende und AMP-bildende Acetyl-CoA Synthetasen aus Haloarcula marismortui und Pyrobaculum aerophilum

Acetat ist eines der wichtigsten Endprodukte energieliefernder Fermentationsprozesse vieler anaerober oder fakultativer Bacteria und Archaea. Darüber hinaus stellt Acetat aber auch ein weit verbreitetes Substrat für Katabolismus und Anabolismus aerober und anaerober, pro- und eukaryontischer Mikroorganismen dar. Bisherige Untersuchungen deuten darauf hin, dass der Mechanismus der Acetatbildung in Prokaryonten domänenspezifisch ist. In Bacteria wird die Acetatbildung von zwei Enzymen, der Acetat Kinase (AK) und der Phosphotransacetylase (PTA), katalysiert, während in Archaea die Acetatbildung von nur einem Enzym, der ADP-bildende Acetyl-CoA Synthetase (ACD), erfolgt. Die Hauptmechanismen der Acetataktivierung, der weitverbreitete Mechanismus über eine AMP-bildende Acetyl-CoA Synthetase (ACS) bzw. der von weniger Organismen beschrittene Mechanismus über den reversiblen AK/PTA-Weg, kommen dagegen beide sowohl in Bacteria als auch in Archaea vor. Untersuchungen zur Acetatbildung in Archaea und dem daran beteiligten Enzym, der ACD, existierten bisher nur für wenige hyperthermophile, anaerobe Euryarchaeota. Zudem lagen über die Acetataktivierung in Archaea, außer für die methanogenen Methanosaeta und Methanosarcina Spezies, keine Informationen vor. Daher sollten in dieser Arbeit das Wachstum der halophilen Archaea auf Glucose und Acetat untersucht und die Enzyme der Acetatbildung und -aktivierung identifiziert, charakterisiert sowie die kodierenden Gene ermittelt werden. Außerdem sollten die Gene, die für die entsprechenden Enzyme in dem hyperthermophilen Crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum kodieren, identifiziert, kloniert und exprimiert sowie die rekombinanten Proteine biochemisch charakterisiert werden. Identifizierung und Charakterisierung der Enzyme der Acetatbildung und -aktivierung in halophilen Archaea Wachstumsexperimente mit den extrem halophilen Archaea Haloarcula marismortui, Halorubrum saccharovorum, Haloferax volcanii und Halococcus saccharolyticus auf Glucose, Acetat und Glucose/Acetat enthaltenden Medien ergaben, dass die Haloarchaea Glucose und Acetat als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen können und dass Glucose gegenüber Acetat das bevorzugte Substrat ist. Zudem konnte mit Enzymmessungen in unterschiedlichen Wachstumsphasen gezeigt werden, dass die Aktivitäten von ACD und ACS substratabhängig reguliert werden. In Phasen der Acetatbildung bei Wachstum auf Glucose stieg die Aktivität der ACD an, wohingegen die der ACS abnahm. Dagegen stieg in Phasen des Acetatverbrauches umgekehrt die ACS Aktivität an, die der ACD nahm aber ab. Zusammen mit dem Befund, dass weder AK noch PTA nachgewiesen werden konnten, zeigten diese Experimente deutlich, dass die Acetatbildung in Haloarchaea von einer ACD katalysiert wird, während die Acetataktivierung über eine induzierbare ACS erfolgt. ACD und ACS wurden aus Ha. marismortui gereinigt und charakterisiert. Die kodierenden Gene wurden identifiziert, kloniert und die rekombinanten Proteine aus Einschlusskörpern reaktiviert und gereinigt. Die ACD ist ein 166 kDa Homodimer und katalysierte die reversible ADP- und Pi-abhängige Acetatbildung aus Acetyl-CoA. Das Enzym benötigte Hochsalzbedingungen (3 M KCl) für die Stabilität und setzte neben Acetat auch Propionat, Butyrat, Isobutyrat und Isovalerat, nicht aber die aromatischen Säuren Phenylacetat oder Indol-3-acetat um. Die ACS ist ein 71 kDa Monomer und katalysierte die ATP- und CoA abhängige Umsetzung von Acetat zu Acetyl-CoA, wobei AMP und PPi gebildet werden. Die ACS benötigte 1.25 M KCl für optimale Aktivität und setzte bevorzugt Acetat um und zusätzlich nur Propionat mit deutlich geringerer Effizienz. Der Km-Wert der ACS für Acetat war mit 0.23 mM etwa 10fach kleiner als der der ACD (2.6 mM). Diese höhere Acetataffinität könnte der Grund für die Induktion der ACS bei Wachstum auf Acetat sein, weil Acetat v.a. in geringen Konzentrationen, wie sie in hypersalinen Habitaten vorkommen, erheblich effizienter aktiviert werden kann. ADP-bildende und AMP-bildende Acetyl-CoA Synthetasen aus dem hyperthermophilen Crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum Im Genom von P. aerophilum wurden Gene identifiziert, die für eine putative ACD und eine ACS kodieren. Die ORFs wurden exprimiert und die rekombinanten Proteine biochemisch charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die ORFs PAE3250 und PAE3249 aus P. aerophilum, die für eine funktionelle ACD kodierten, eine für bisher charakterisierte ACD ungewöhnliche Genstruktur aufwiesen. Beide ORFs lagen im Genom einander überlappend vor, bildeten aber keinen einheitlichen Leserahmen. Demzufolge bestand das Enzym aus zwei Untereinheiten (50 kDa und 28 kDa) und zeigte eine heterooligomere Struktur. Die P. aerophilum ACD zeigte eine bisher für ACD nicht beschriebene Substratspezifität. Neben Acetyl-CoA wurden mit signifikanten Aktivitäten auch Isobutyryl-CoA und Phenylacetyl-CoA umgesetzt. Daneben wies das Enzym ein Temperaturoptimum von über 93°C und hohe Thermostabilität bis 100°C auf. Die von dem ORF PAE2867 kodierte ACS aus P. aerophilum ist ein thermostabiles Enzym mit einer für ACS einzigartigen oligomeren Struktur. Das aus 77 kDa Untereinheiten bestehende Enzym wurde als 615 kDa Homooktamer charakterisiert. Das Enzym zeigte ein Temperaturoptimum von über 97°C und wies eine breitere Substratspezifität auf als alle bisher charakterisierten ACS. Neben Acetat wurden auch Formiat, Propionat, Butyrat und Isobutyrat als Substrate akzeptiert. Außerdem waren die Substrataffinitäten z.B. für Acetat (Km-Wert 3 µM) 100fach höher als für die meisten charakterisierten ACS. Sequenzvergleiche der in dieser Arbeit charakterisierten archaeellen ACS mit anderen bekannten und putativen ACS Sequenzen zeigten, dass diese Enzyme in allen drei Domänen hochkonservierte Proteine sind. Phylogenetische Analysen mit ACS Sequenzen aus allen drei Domänen ergaben eine separate archaeelle Gruppe, zu der auch die ACS aus P.aerophilum gehörte. Dieses spricht für eine monophyletische Entwicklungslinie der archaeellen ACS