Tiefencharakterisierung des intestinalen Transkriptoms der Maus mittels RNA-Seq

Die Schleimhaut des Darmtraktes ist charakterisiert durch komplexe metabolische und immunologische Prozesse und wird gesteuert durch hochdynamische Genexpressions-Programme. Mit der Verfügbarkeit von next generation sequencing und ihrer Nutzbarkeit für die Analyse von RNA-Sequenzen wurde die Genauigkeit über die globale Architektur des Transkriptoms gegenüber anderen Methoden wie microarrays auf eine neue Ebene befördert. Basierend auf dem 3‘ Oligo-dT priming von polyadenylierten Boten-RNA gefolgt von reverser Transkription und einem sogenannten template switch wurde eine Methode für RNA-Seq auf der Life Technologies SOLiD Plattform etabliert. Dieser Ansatz zeigte zuverlässige Informationen über das untersuchte Gewebe, z. B. in Bezug auf Genexpression und der Beobachtung von nicht-annotierten, transkriptionell aktiven Bereichen im Genom. In dieser Arbeit wird über die Tiefencharakterisierung des polyadenylierten Transkriptoms in zwei nah verwandten, dennoch unterschiedlichen Geweben des murinen Intestinaltrakts (Dünn- und Dickdarm) berichtet. Eine gewebespezifische Architektur des Transkriptoms und die Präsenz von zuvor nicht bekannten Bereichen transkriptioneller Aktivität wurden gefunden. Im ersten Schritt wurden Signaturen von 20.541 NCBI-RefSeq-Transkripten im Darm identifiziert (74,1 % der annotierten Gene), davon fanden sich 16.742 in beiden untersuchten Geweben. Obwohl die Mehrheit der Sequenzen annotierten Genen zugeordnet werden konnten, fanden sich 27.543 nicht-annotierte, transkriptionell aktive Regionen im Genom im Widerspruch zur aktuellen Genannotationen von RefSeq oder Ensembl. Unter Nutzung eines zweiten, unabhängigen, strangspezifischen Protokolls konnten 20.966 dieser Befunde bestätigt werden, die Mehrheit davon in direkter Nähe zu bekannten Genen. In der Folge wurden die Befunde bezüglich ihrer Nähe zu beschriebenen Exon-Elementen kategorisiert. Regionale Unterschiede zwischen Dünn- und Dickdarm dieser transkriptionell-aktiven, aber nicht annotierten Elemente wurden untersucht. Die vorliegende Arbeit demonstriert die Komplexität eines typischen intestinalen mRNA-Transkriptoms von Säugetieren anhand einer strangspezifischen Auflösung bis hin zur Einzelbase. Die Analysen zeigten zum ersten Mal ein strangspezifisches Bild von nicht-annotierten, transkriptionell aktiven Bereichen in zwei Geweben und repräsentieren eine Ressource für weitere Untersuchungen transkriptioneller Prozesse, welche zur molekularen Gewebeidentität beitragen. Die mittels RNA-Seq in dieser Arbeit erhobenen Daten waren von hoher, zuvor nicht zugänglicher Qualität, so dass RNA-Seq in der Zukunft vermutlich die neue Standardmethode für die genomweite Untersuchung des Transkriptoms darstellen wird.The intestinal mucosa is characterized by complex metabolic and immunological processes driven highly dynamic gene expression programs. With the advent of next generation sequencing and its utilization for the analysis of the RNA sequence space, the level of detail on the global architecture of the transcriptome reached a new order of magnitude compared to other methods like microarrays. A method for RNA-Seq based on 3’ oligo-dT priming of polyadenylated messenger RNA followed by reverse transcription and a template switch was established on the Life Technologies SOLiD platform. This approach showed robust information about the characterized tissue, for example in terms of gene expression and the observation of non-annotated transcriptionally active regions of the genome. This thesis reports the ultra-deep characterization of the polyadenylated transcriptome in two closely related, yet distinct regions of the mouse intestinal tract (small intestine and colon). The tissue-specific transcriptomal architecture and the presence of novel transcriptionally active regions were assessed. In the first step, signatures of 20,541 NCBI RefSeq transcripts could be identified in the intestine (74.1% of annotated genes), thereof 16,742 are common in both tissues. Although the majority of reads could be linked to annotated genes, 27,543 non-annotated transcriptionally active regions not consistent with current gene annotations in RefSeq or Ensembl were identified. By use of a second independent strand-specific RNA-Seq protocol, 20,966 of these nTARs were confirmed, most of them in vicinity of known genes. This thesis further categorized the findings by their relative adjacency to described exonic elements and investigated regional differences of novel transcribed elements in small intestine and colon. The current study demonstrates the complexity of an archetypal mammalian intestinal mRNA transcriptome in high resolution and identifies novel transcriptionally active regions at strand-specific, single base resolution. The analysis for the first time shows a strand-specific comparative picture of non-annotated transcriptionally active regions in two tissues and represents a resource for further investigation of the transcriptional processes that contribute to molecular tissue identity. RNA-Seq generated data showed high, to date unseen quality. This suggests that RNA-Seq will be the new standard method for genome-wide analysis of the transcriptome