Biochemische Charakterisierung und Hemmung von drei Formiat-Nitrit-Transportern (FNT) aus Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii ist ein weltweit vorkommender, pathogener Parasit der Familie Apicomplexa. Er infiziert nahezu alle Wirbeltiere und kann sich auf verschiedene Umwelteinflüsse und Zellkompartimente einstellen. Dies spiegelt sich auch im komplexen Stoffwechsel des Parasiten wider. Die sich schnell teilende tachyzoite Form des Parasiten generiert hauptsächlich Energie über die Glykolyse unter Produktion des Endproduktes L-Laktat. Wird dies nicht ausgeschleust, kommt es zum Absterben des Parasiten. Alternativ zur Glukose kann der Parasit jedoch auch andere Kohlenstoffquellen wie Acetat verstoffwechseln, die über die Membran aufgenommen werden müssen. In dieser Arbeit konnten drei Formiat-Nitrit-Transporter (FNT) aus T. gondii als Monocarboxylat/Protonen-Symporter charakterisiert werden, die in der Plasmamembran von Tachyzoiten lokalisiert sind. Alle drei leiteten die Substrate Formiat, Acetat und L-Laktat. Der Transport war hierbei abhängig vom Protonengradienten und konnte über 2-Hydroxy-Chromanone im unteren mikromolaren Bereich gehemmt werden. Auch konnte die Wirkung dieser Verbindungen auf das Wachstum von T. gondii-Tachyzoiten gezeigt werden. Dies wies auf eine essentielle Bedeutung des L-Laktat-Transportes hin. Auch der Import des Nährstoffes Acetat konnte über die FNTs realisiert werden. Weiterhin konnte durch chemische Modifikation an kritischen Aminosäuren, die für die Selektivität des Transportes entscheidend sind, der Selektivätsfilter dieser Transporter identifiziert werden. Dieser bestimmte die Sensitivität der Proteine hinsichtlich der Substrat-Leitfähigkeit und Inhibitor-Affinität. Durch Charakterisierung zweier weiterer FNTs aus den Piroplasmen Babesia bovis und Theileria equi konnten die Ergebnisse auf die Familie der Apicomplexa übertragen werden. Auch diese leiteten die Substrate Formiat, Acetat und L-Laktat. Dies zeigte eine evolutionäre Entwicklung der wohl ursprünglich prokaryotischen FNTs hinsichtlich ihrer Substrat-Selektivität, um eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel klinisch relevanter eukaryotischer Parasiten zu erfüllen.Toxoplasma gondii is a globally prevalent apicomplexan parasite. The pathogenic parasite has the ability to infect virtually all nucleated vertebrate cells and can adapt to many different environmental influences. This is reflected by the unique and complex metabolic architecture of the parasite. The fast-growing tachyzoite stage catabolizes glucose via glycolysis to yield L-lactate as a major endproduct. If L-lactate is not exported it results in death of the parasite. Additionally, the parasite is able to utilize acetate as a carbon source if glucose is not available. This nutrient has to be transported across the plasma membrane into the parasite. In this work, three T. gondii formate-nitrite transporters (FNT) were reported to be monocarboxylate/proton-symporters, which are located at the plasma membrane of the tachyzoite stage. All three transported formate, acetate and L-lactate. The transport was dependent on the proton motive force and could be selectively blocked in a micromolar range using 2-hydroxy-chromanones. Likewise it could be shown that these compounds inhibit the growth of Toxoplasma gondii-tachyzoites. This indicated a critical role of L-lactate export. It was also shown, that the import of the altenative nutrient acetate could be carried out by these FNTs. Further, by chemically modification of critical amino acid residues which determine the selectivity of substrate transport a selectivity filter in these transporters could be identified. This filter discriminates the sensivity torwards substrate transport and inhibitor affinity. Additionally, by characterization of two piroplasm FNTs from Babesia bovis and Theileria equi the generated results could be transferred to the Apicomplexa family of pathogenic parasites. These proteins also transported formate, acetate and L-lactate. This showed the evolution of initially prokaryotic transporters with respect to substrate selectivity to fulfill a critical role in the energy metabolism of clinically important eukaryotic parasites