Charaktersytyka molekularna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płytek krwi oraz z moczu oraz ich potencjalne zastosowania w nanomedycynie

Prezentowana praca doktorska jest poswiecona badaniom pecherzyków zewnatrzkomórkowych (z ang. extracellular vesicles; EVs) oraz ich potencjalnemu zastosowaniu w dziedzinie nanomedycyny. Pecherzyki zewnatrzkomórkowe sa kulistymi strukturami błonowymi, wydzielanymi przez wiekszosc komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w stanach patologicznych organizmu. Po wydzieleniu z komórki, pecherzyki trafiaja do płynów ustrojowych, z których nastepnie moga zostac wyizolowane. Termin "pecherzyki zewnatrzkomórkowe" obejmuje struktury, które róznia sie: rozmiarem (30-4000 nm), procesem powstawania, a takze składem molekularnym. Pecherzyki sa nosnikiem róznorodnego materiału biologicznego, w tym białek, lipidów, kwasów nukleinowych oraz metabolitów. Ze wzgledu na to, ze pecherzyki posiadaja charakterystyczna sygnature molekularna, która odzwierciedla ich pochodzenie, stały sie one potenjalnymi biomarkerami chorób, w tym cukrzycy i jej powikłan. Głównym celem pracy było scharakteryzowanie własciwosci fizycznych oraz molekularnych pecherzyków pochodzacych z dwóch róznych zródeł: mocz oraz aktywowane płytki krwi. W ramach pracy sformułowano nastepujaca hipoteze robocza: "Wybrane własciwosci fizyczne oraz skład molekularny pecherzyków zewnatrzkomórkowych moga znalezc zastosowanie w diagnostyce cukrzycy oraz jej powikłan". Wykonanie szczegółowej charakterystyki pecherzyków było mozliwe dzieki zastosowaniu szeregu metod. Własciwosci fizyczne (morfologia, rozmiar, stezenie, potencjał zeta) scharakteryzowano z wykorzystaniem nastepujacych metod: dynamiczne rozpraszanie swiatła, sledzenie trajektorii ruchu czastek (z ang. Nanoparticle Tracking Analysis), dostrajalny czujnik zmian rezystancji (z ang. Tunable Resistive Pulse Sensing) oraz mikroskopia elektronowa. Analize składu molekularnego pecherzyków pochodzacych z moczu osób zdrowych oraz pacjentów z cukrzyca wykonano za pomoca spektroskopii Ramana oraz spektrometrii mas. Dodatkowo wykonano analize profilu miRNA pecherzyków wyizolowanych z moczu za pomoca sekwencjonowania nowej generacji (z ang. Next Generation Sequencing; NGS). Wyniki uzyskane w ramach niniejszej pracy doktorskiej, wykazały, ze zarówno wybrane własciwosci fizyczne, jak i skład molekularny pecherzyków moga znalezc zastosowanie w diagnostyce stopnia wyrównania glikemii u chorych z cukrzyca, a takze w diagnostyce cukrzycowej choroby nerek. Wramach pracy zaproponowano nowatorska metode diagnozowania stopnia uszkodzenia nerek u pacjentów z cukrzyca w oparciu o sygnature molekularna pecherzyków zewnatrzkomórkowych.Presented Thesis is devoted to extracellular vesicles and their potential applications in the field of nanomedicine. Extracellular vesicles (EVs) are membranous, spherical structures, which are released by most cell types both at physiological and pathological conditions. After secretion from cell, EVs circulate in the body fluids, from which they can be isolated. The term "extracellular vesicles" includes structures that differ in size (30-4000 nm), biogenesis process and molecular composition. The EVs are carriers of variety of biological molecules, including proteins, lipids, nucleic acids and metabolites. Due to the fact that EVs have characteristic molecular signature that reflects their origin, they have become potential biomarkers of diseases, including diabetes and its complications. The main goal of this Thesis was to characterize physical and molecular properties of EVs derived from two different sources: urine and activated platelets. As a part of this work, the following working hypothesis was formulated: "Selected physical and molecular properties of EVs can be used in the diagnostics of diabetes and its complications". The detailed characteristics of EVs was possible due to the use of a number of methods. Physical properties (size, concentration, zeta potential) of EVs were characterized using the following techniques: dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, tunable resistive pulse sensing and electron microscopy. Characteristics of specific molecular signatures of EVs from urine (UEVs) of healthy subjects and diabetic patients was obtained by means of Raman spectroscopy and mass spectrometry methods. Additionally, miRNA profile of UEVs was analyzed by Next Generation Sequencing (NGS) technology. The results obtained as a part of this doctoral Thesis, showed that both selected physical properties and the molecular composition of EVs can be used in the diagnostics of patients with the different levels of glycemic control, as well as in the diagnostics of diabetic kidney disease. Within this Thesis, a novel method for diagnosing the stage of kidney damage in diabetic patients based on the molecular signature of EVs was proposed