Dipeptidil peptidaz IV enziminin saflaştırılması karaklterizasyonu ve inhibitörlerinin belirlenmesi

Dipeptidil peptidaz IV (EC 3.4.14.5); immun cevap, T hücre aktivasyonu, sinyal transdüksiyonu, T hücre proliferasyonu ve metabolik homeastazın kontrolünde kritik fonksiyona sahip birçok biyolojik aktif peptidin hidrolizinden sorumlu multifonksiyonel bir serin ekzopeptidazdır. Bu çalışmada; Dipeptidil peptidaz IV enzimi koyun akciğerinden amonyum sülfat çöktürmesi sonrası sırasıyla; DEAE-Sefaroz, Con A ve Gly-Pro- Sepabead EC-HA afinite kromatografileri kullanılarak % 6 verimle 370 kat saflaştırıldı. Non-denature PAGE ve SDS-PAGE jellerde aktivite/glikoprotein boyaması ve triptik peptidlerin LC-MS/MS analizi ile enzimin (DPPIV) varlığı teyid edildi. Enzimin karbohidrat içeriği % 18,9 olarak belirlendi. Saflaştırılan DPPIV enziminin CD26 primer antikorlarına karşı reaksiyon vermemesi CD26 ve akciğer DPPIV'ünün identik olmadığını gösterdi. Koyun akciğerinden saflaştırılan DPPIV'ün molekül kütlesi SDS-PAGE'de 90 kDa, jel filtrasyon kromatografisi sonrası yapılan değerlendirmeler ile yaklaşık 180 kDa olarak belirlendi ve enzimin dimerik yapıda olduğu düşünüldü. İzoelektrik noktası yaklaşık 4,8 ± 0,2 olarak belirlendi. Enzimin optimum sıcaklık ve pH'sı; 45 °C ve 7,4 olarak bulundu. Gly-Pro-pNA substratı kullanılarak KM ve Vmax değerleri; 0,32 mM ve 35,9 μmol/dk/mg olarak hesaplandı. DPPIV'ün termal ve pH kararlılığı; 0-45 °C ve pH 7,0 - 9,0 aralığında % 100 ve % 94 olarak belirlendi. Ayrıca, enzimin -80 °C'de 8 hafta depolama süresi sonrası aktivitesinin % 88'ini koruduğu gözlendi. Zn+2, Hg+2 ve Cd+2'nin koyun akciğer DPPIV enzimine inhibisyon etkisi gösterdiği buna karşın Mg+2 iyonlarının enzim aktivitesini arttırdığı belirlendi. 0,1 mM Diprotin A ile enzim aktivitesinin % 91'inin inhibe edildiği bulundu. PMSF ve 1-10 fenantrolinin 0,1-5,0 mM konsantrasyonlarında, konsantrasyon artışına paralel olarak enzim inhibisyon etkinliklerinin arttığı; aynı konsantrasyon aralıklarında β-mercaptoethanol ve DTT'nin enzimi çok az inhibe ettiği tespit edildi. Serin proteaz inhibitörlerinden benzamidin ve pABA'nın sadece yüksek konsantrasyonlarında inhibisyon etkisi göstermesinin enzimin tripsin benzeri serin proteazlarla olan substrat afinite farklılığından kaynaklandığı düşünüldü. Enzimin; prolin içeren sentetik ve doğal substratları daha hızlı, alanin içerenleri ise daha yavaş hidrolizlediği gözlendi. İleri aşamada DPPIV enziminin inhibisyonuna yönelik yapılan tarama çalışmasında; en fazla inhibitör etkisi sulu ekstraksiyonla hazırlanan bitkilerden Dulavrat otu (Arctium tomentesum) ve Aslan pençesi (Alchemilla vulgaris)'nde gözlendi ve IC50 değerleri sırasıyla 4,6 ve 16,9 μg/ml olarak hesaplandı. Dulavrat otunun IC50 değeri, DPPIV inhibitörü olan Diprotin A'ya göre (10,1 μg/ml) daha etkin bulundu