α-galaktozidaz enziminin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için ters misel sistemlerinin geliştirilmesi

α-D-Galaktozidazlar (α-D-galaktozid galaktohidrolaz, EC 3.2.1.22) doğada oldukça yaygın olarak bulunan hidrolaz sınıfı enzimlerdir. Bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan çok çeşitli teknikler ile izole edilerek saflaştırılan bu enzimler galaktooligosakkaritler ve polisakkaritlerde bulunan α-1,6-galaktoz birimlerini hidrolizlerler. Özellikle şeker endüstrisinde önemli bir potansiyele sahip olan α-galaktozidazlar, kompleks karbohidratların biyolojik fonksiyonlarının belirlenmesinde, organik sentezlerde, yapı analizlerinde ve medikal alanda oldukça önemli uygulama alanları olan enzimlerdir. Bu çalışmada, mısırdan (Zea mays) izole edilen α-D-galaktozidaz enzimi ters misel sistemi (Reverse Mİcelles Systems; RMs) kullanılarak saflaştırıldı. Ters misel sisteminde misel oluşturmak için surfaktan olarak Aerosol OT (AOT) ve setil trimetil amonyum bromür (CTAB) surfaktanları kullanıldı. Ters misel sistemini optimize etmek ve enzimi iyi bir verimle saflaştırabilmek için sistemi etkileyen temel parametreler (surfaktan tipi ve konsantrasyonu, pH, iyonik şiddet, sisteme eklenen protein miktarı, sulu faz/organik faz oranı) incelendi. Saflaştırılan α-galaktozidaz enzimi karakterize edildi. Bu amaçla, enzim aktivitesine ve kararlılığına sıcaklık ve pH'ın etkisi incelenerek kinetik sabitler (Km ve Vmax) belirlendi. Ayrıca, α-galaktozun enzim aktivitesine etkisi araştırıldı ve inhibisyon kinetiği belirlendi. Sonuç olarak Aerosol OT (AOT) tabanlı ters misel sistemi için oda sıcaklğında 50 mM'lık sitrat tamponuyla (pH 6), 50 mM KCl tuz çözeltisi ve 1 mg protein içerek şekilde, 1:1 faz oranı (v/v) ile sistem hazırlandı. Setil trimetilamonyum bromür (CTAB) ters misel sistemi için ise yine oda sıcaklığında 50 mM'lık sitrat tamponuyla (pH 4.5), 2 mg protein içerek şekilde, 1:1 faz oranı (v/v) ile sistem hazırlandı. Optimize edilmiş koşullarda, ters misel sistemi ile Ü- galaktozidaz enzimi AOT surfaktanı içeren ters misel sistemiyle %47 aktivite verimi ile 4,8 kat saflaştırıldı, CTAB surfaktanı içeren ters misel sistemiyle ise %89 aktivite verimi ile 2,0 kat saflaştırıldı. Her iki ters misel sistemi ile saflaştırılan enzimlerinin optimum sıcaklık ve optimum pH ‘sı sırasıyla 37°C ve pH 4,5 olarak belirlendi. Saflaştırılan enzimin, 4-50°C ve pH 4.0-6.5 aralığında oldukça kararlı olduğu belirlendi. α-Galaktozidaz enziminin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 4.54 mM ve 0.05 U (AOT tabanlı ters misel sistemi) olarak belirlendi, 2.27 mM ve 0.29 U (CTAB tabanlı ters misel sistemi) olarak hesaplandı. DGalaktozun α-galaktozidaz enzimi inhibitörü olduğu ve inhibisyon tipinin kompetetif olduğu belirlendi. Geleneksel çok adımlı metodlara kıyasla α- galaktozidaz enziminin saflaştırılmasında kullanılan bu tek adımı ters misellerle ekstraksiyon metodu bast, ekonomik ve etkili bir metod olup hazırlanan enzim preperatı sahip olduğu katalitik özellikler bakımından endüstriyel alanda kullanılabilecek uygun bir enzim preperatıdır