Nükleik aside dayalı elektrokimyasal biyosensörler ile hibridizasyon algılanmasına ait yöntemlerin geliştirilmesi ve uygulanması

Tez çalışmasında, GSTP1 promotor bölge hipermetilasyonunun ve JAK2 tek nokta mutasyonunun algılanması için Diferansiyel Puls Voltametrisi (DPV) ve Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) kullanılmıştır. Her iki çalışmada; kalem grafit elektrot, yardımcı elektrot ve referans elektrottan oluşan 3'lü elektrot sistemi kullanılmıştır. Hibridizasyon tayini için, hibridizasyon öncesi ve sonrasında DNA'nın en aktif bazlarından biri olan ve yaklaşık +1,0 V'da yükseltgenen guanin bazı sinyallerindeki değişim dikkate alınmıştır. Tez çalışmasının ilk kısmında, prostat kanserinin spesifik bir belirteci olan GSTP1 geninin hibridizasyon üzerinden hipermetilasyon tayini için elektrokimyasal bir biyosensör tasarlanmıştır. Bu yeni biyosensör sistemi ile sentetik veya PCR örneklerinin hibridizasyonundan önce ve sonra elde edilen guanin yükseltgenme sinyal değişiklikleri değerlendirilmiştir. DNA hibridizasyonu ayrıca, EIS ile karakterize edilmiştir. Ayrıca, GSTP1 promotor bölge hipermetilasyonunun hibridizasyon ile tayini çalışmasında, işaretli DNA hibridizasyon algılama yöntemlerinden biri olan interkalatör bir madde aracılığıyla hibridizasyon tayini gerçekleştirilmiştir. Hibridizasyon protokolü iki farklı teknikten oluşmaktadır: (i) GSTP1 dizileri metilasyon spesifik bölgesi için seçici olan prob ve hedef sensör yüzeyine doğrudan immobilize edilmiş ve hibridizasyon elektrot yüzeyinde gerçekleştirilmiştir. (ii) prob/hedef veya prob/rastgele dizi çiftleri çözelti fazında karıştırılmış ve elektrot basit adsorbsiyonla modifiye edilmiştir. GSTP1 hipermetilasyonunu algılamaya yönelik tasarladığımız elektrokimyasal DNA biyosensör sistemi ile 100 ol reaksiyon hacminde 2.92 pikomol seviyesinde tayin sınırına ulaşılmıştır. İkinci kısımda JAK2 geninin 1849. bazında Guanin bazının Timine değişmesi sonucunda valinin fenilalanine yerdeğiştirmesine (JAK2V617F) sebep olan tek nokta mutasyonu elektrokimyasal biyosensör ile algılanmıştır. Prob ile hedef arasındaki hibridizasyon ve sağlıklı dizilerden mutasyonlu dizilerin ayırt edilmesi DPV ile sentetik ve denatüre PCR örneklerde gerçekleştirilmiştir. Prob/hedef, prob/tek bazı hedeften farklı dizi ve prob/rastgele dizi çiftleri çözelti fazında karıştırılmış ve bu çözeltiler daha sonra elektrot yüzeyine pasif adsorbsiyon ile immobilize edilmiştir. JAK2V617F tek nokta mutasyonunun analizi çalışmasında, 40 ol reaksiyon hacminde 44 pikomol seviyesinde tayin sınırına ulaşılmıştır