Biyospesifik enzim immobilizasyon teknikleri ile α-galaktozidaz enziminin immobilizasyonu

α-D-Galaktozidazlar (α-D-galaktozid galaktohidrolaz, EC 3.2.1.22) doğada oldukça yaygın olarak bulunan hidrolaz sınıfı enzimlerdir. Bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan çok çeşitli teknikler ile izole edilerek saflaştırılan bu enzimler basit ve kompleks galakto-oligosakkaritler ve polisakkaritlerde bulunan α-1,6-galaktoz birimlerini hidrolizlerler. Şeker endüstrisinde önemli bir potansiyele sahip olan α-galaktozidazlar, kompleks karbohidratların biyolojik fonksiyonlarının belirlenmesinde, organik sentezlerde, yapı analizlerinde ve medikal alanda ve şeker endüstrisinde oldukça önemli uygulama alanları olan enzimlerdir. Enzim immobilizasyonu teknolojisi enzimlerin tekrar kullanılabilmesini sağlamak ve kararlılığını geliştirmek için etkin bir aracıdır. Enzimlerin immobilizasyonu için bazı protokoller mevcuttur; ancak çok azı basit ve/veya enzim özelliklerini geliştirebilir niteliktedir. Bu nedenle, günümüzde yeni immobilizasyon protokollerine ihtiyaç duyulmaktadır. Enzimlerin immobilizasyonunda yeni trend enzim ve taşıyıcı arasında çeşitli biyoafinite bağlarının oluşturulmasıdır. Biyoafinite immobilizasyonunda, enzim biyospesifik etkileşimler vasıtasıyla taşıyıcıda immobilize edilir. Bu çalışmada, α-galaktozidaz enzimi domatesten (Lycopersicon esculentum) izole edilerek, biyoafinite protokolü ile kitosanda (doğal bir polimer) üç farklı biyoafinite protokolü (Yöntem I, II ve III) ile immobilize edildi. Yöntem I ile immobilizasyon protokolünde kitosan önce glutaraldehit ile aktive edildi ve ardından konkanavalin A (ConA) ile türevlendirildi. İmmobilizasyon protokolünün optimizasyonu için immobilizasyona ortam pH’sı, iyon şiddeti, protein miktarları ve metallerin etkisi incelendi ve enzim glutaraldehit ile çapraz bağlandı. Yöntem II ile immobilizasyonda, kitosan taşıyıcıda ConA adsorplanarak taşıyıcı türevlendirildi. Ardından adsorpsiyon zamanı, protein miktarı, immobilizasyon ortamın pH’ sı ve iyon şiddeti gibi parametrelerin enzim immobilizasyonuna etkisi incelendi ve enzim glutaraldehit ile çapraz bağlandı. Son olarak yöntem III ile enzim immobilizasyonunda, yöntem I için optimize edilen koşullarda enzim afinite tabakaları oluşturularak immobilize edildi. Önce afinite tabaka sayısı ve ardından ortama ilave edilen Con A ve protein miktarları optimize edildi. Her üç yöntemle hazırlanan biyoafinite taşıyıcısında α-galaktozidaz enziminin immobilizasyonu gerçekleştirildi. Serbest ve immobilize enzimlerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonu gerçekleştirildi. Enzim aktivitesine etki eden bazı parametreler (pH, sıcaklık, substrat konsantrasyonu) incelenerek kararlılık testleri (pH, termal, depo ve operasyonel) yapıldı. İmmobilize enzimlerin tekrar kullanılabilirliği de test edildi. Serbest ve immobilize α-galaktozidaz enzimleri PNPG ve rafinoz hidroliz prosesinde kullanıldı