ATP syntaasin aktiivisuuden säätelystä – F-ATP syntaasin DAPIT rakenneproteiini ja sen yli-ilmentämisen vaikutukset HEK293T soluissa

Tyypin 1 diabetes on monimutkainen metabolinen häiriötila, joka aiheuttaa muutoksia solun fysiologiaan, aineenvaihduntaan ja geenien ilmentymiseen. Insuliinin puutoksen tiedetään aiheuttavan hiiren kudoksissa geenisäätelyn häiriintymistä mm. laskemalla mitokondriaalisen elektroninsiirtoketjun proteiinien mRNA-tasoja. Sen sijaan energiaa tuottavan ATP-syntaasin rakenneyksiköiden ilmentyminen diabeteksessa on proteiinitasolla vielä tuntematonta, kuten ilmentymisen vaikutukset itse entsyymikompleksin aktiivisuuteenkin. Tässä väitöskirjatyössä on löydetty ja karakterisoitu ATP-syntaasin Fo kompleksin rakenneproteiini Diabetes Associated Protein in Insulin-sensitive Tissues, DAPIT. Lisäksi sen yli-ilmentymisen vaikutusta solun fysiologiaan on luonnehdittu molekyylibiologisin keinoin diabeettisen ja muun tautiyhteyden selventämiseksi. Väitöskirja koostuu kolmesta erillisestä osatyöstä. Osatyössä I DD-PCR-, sekvensointi-, Northern blot-menetelmien sekä tietokantahaun avulla löydettiin, nimettiin ja karakterisoitiin uusi proteiini, DAPIT, tyypin 1 diabeettisen rotan insuliiniherkistä kudoksista. Osatyössä II karakterisoitiin erikoisvalmisteinen, DAPITin tunnistava vasta-aine, jonka avulla proteiinin ilmentyminen havainnollistettiin immunohistokemiallisesti useissa rotan ja ihmisen kudoksissa. Lisäksi vahvistettiin DAPITin mitokondriaalinen esiintyminen solutasolla, sekä havaittiin lysosomaalinen ilmentyminen. DAPITin ilmentymistä tutkittiin myös diabeettisen rotan ja hiiren insuliiniherkissä kudoksissa, ja havainnollistettiin sen lihassäie-spesifinen esiintyminen hiiressä. Väitöskirjan osatyössä III geenimuuntelun avulla rakennettiin DAPITia yli-ilmentävä solulinja, jonka mitokondrioita, energia-aineenvaihduntaa, morfologiaa ja käyttäytymisominaisuuksia selvitettiin. Osatyö I tuotti uuden DAPIT-proteiinin, joka osoittautui konservoituneeksi eläinkunnassa. Terveellä rotalla proteiinin lähetti-RNA ilmeni runsaana mm. insuliiniherkissä kudoskissa. Diabeettisella rotalla lähetti-RNAn ilmentyminen oli alentunut sydämessä ja lihaksessa kontrollikudokseen verrattuna. Osatyössä II DAPITin aminohapposekvenssin karboksyylipäähän suunniteltu vasta-aine tunnisti kohteensa sekä solu- että kudostasolla. Vasta-aineen avulla nähtiin DAPITin erityinen ilmentyminen mitokondrioissa ja lysosomeissa. Aminopäähän suunniteltu vasta-aine ei ollut yhtä luotettava jokaisessa sovelluksessa. Ihmisen ja rotan kudosten immunohistokemiallisessa tutkimuksessa DAPITia esiintyi runsaasti aerobista aineenvaihduntaa hyödyntävissä insuliiniherkissä kudoksissa, sekä aktiivisesti ravinteita ja ioneja kuljettavissa epiteelirakenteissa. Diabeettisen rotan insuliiniherkkien kudosten tutkimus osoitti DAPITin proteiinitason olevan koholla, toisin kuin lähetti-RNA tasolla, sydämessä, lihaksessa ja rasvassa mutta alentunut maksassa normaaliin kudokseen verrattuna. Terveen ja diabeettisen hiiren lihaksessa eroja sen sijaan ei havaittu lihasyhdistelmän runsaan säietyyppivaihtelun vuoksi. Osatyössä III DAPITia aktivoidusti ilmentävässä solulinjassa havaittiin merkittävä mitokondriaalinen haitta proteiinin normaalia runsaamman esiintymisen seurauksena: Energiaa tuottavan ATP-syntaasin aktiivisuus laski lisääntyneestä soluhengityksestä huolimatta. Tämän seurauksena syntyi mitokondrioiden tuottamia happiradikaaleja, jotka todennäköisesti säätelivät transkriptiotekijöitä, siten edistäen anaerobista aineenvaihduntaa ja solun taantumista. Lopulta epiteelityypin solu muuntui mesenkymaaliseksi hidastaen jakautumistaan ja liikkumistaan. Geenien monistumisesta raportoiva tietokanta osoitti DAPITin lisääntyneen ilmentymisen olevan runsasta useissa syöpäsolulinjoissa ja syövissä, ehdottaen sillä olevan syöpiä edistäviä onkogeenisia ominaisuuksia. Tämän väitöskirjan tutkimukset mahdollistivat uuden DAPIT proteiinin löytymisen insuliinipuutostilanteessa. Teetetyn vasta-aineen avulla sen ilmentyminen havainnollistettiin solu- ja kudostasolla ihmisen ja jyrsijän terveissä ja diabeettisissa kudoksissa. Normaalia runsaammin ilmentyessään DAPIT aiheuttaa ATP-syntaasin aktiivisuuden heikentymistä huolimatta hengitysketjun toiminnan aktivoitumisesta. Tämän seurauksena solun aineenvaihdunta ohjautuu glykolyysiin, mikä morfologiatasolla näkyy epiteeliominaisuuden häviämisenä. Solu taantuu monella tapaa osoittaen useita syöpien kantasolujen ominaisuuksia, joista on keskusteltu. Tutkitun solulinjan ja tyypin 1 diabeteksen lisäksi kirjallisuuden ja tietokantojen perusteella DAPITin runsasta ilmentymistä lähetti-RNA tasolla esiintyy myös muissa patofysiologissa tautimalleissa ja tiloissa, kuten Parkinsonin taudissa, multippelissa skleroosissa, painon nousussa, sydämen vajaatoiminnassa ja arseenialtistumisessa. Tämä väitöskirja yhdessä kirjallisuuden kanssa viitoittavat runsaan DAPITin ilmentämisen mahdollisesti olevan yleinen ominaisuus, joka vaikuttaa ATP-syntaasin aktiivisuuteen ja siten energiantuottoon sairauksissa ja tiloissa, joihin metaboliset häiriöt osallistuvat. Näihin kuuluvat mm. diabetes, syöpä, degeneroivat ja autoimmuunisairaudet, sekä myrkkyjen ja epigenetiikan säätelemät tilat. Kudosten ja solutyyppien patologisia muutoksia väitöskirjassa kuvatun mitokondriaalisen haitan seurauksena selventäisi geneettisellä ohjauksella DAPITia runsaasti ilmentävä hiiri, jonka karakterisoiminen mahdollistaisi yleisemmän haitan vaikutusten tunnistamisen.Type 1 diabetes (TD1) is a complex metabolic disorder accompanied by alterations in cellular physiology, metabolism and gene expression. Previously it has been shown that in type I diabetic mice several mRNAs coding the proteins of complexes in the electron transport chain in the mitochondria are down-regulated. However, it is not known how diabetes affects the composition or activity of the mitochondrial energy-producing enzyme, ATP synthase. This study discovered and characterized a supernumerary subunit, Diabetes Associated Protein in Insulin-sensitive Tissues, DAPIT, of the ATP-synthase membrane-imbedded Fo complex. In addition, the effects of over-expression of DAPIT on cellular and molecular level were characterized to clarify its consequences in type 1 diabetes. This thesis comprises three separate studies. Study I discovered, named and characterized a novel protein, DAPIT, in the insulin-sensitive tissues of a type 1 diabetic rat by differential display (DD-PCR) methodology, sequencing, Northern blot and database search. In study II a custom-made antibody against DAPIT was characterized, the protein histological expression in several rat and human tissues was described and its mitochondrial presence at cellular level was confirmed. Furthermore, it was proposed that DAPIT could be a common component of proton pumps. Also, the protein level of DAPIT and its myofiber-type specific expression was studied in insulin-sensitive tissues of healthy and diabetic rats and the muscle calf complex of mice. Finally, in study III a gene-manipulated cell line over-expressing DAPIT was constructed and characterized at mitochondrial, metabolic, morphological and behavioral levels. Study I revealed that DAPIT was a small membrane-spanning protein conserved in the animal kingdom. In healthy rat its mRNA was highly expressed in aerobic, including insulin-sensitive tissues. In diabetic rats the mRNA expression was down-regulated in the myocardium and skeletal muscle compared to control tissues. The results of study II showed that the antibody against the carboxy-terminal end of DAPIT recognized the protein at both cellular and tissue levels. Exploiting this antibody, mitochondrial and lysosomal expression of DAPIT was demonstrated. The antibody against the amino-terminus of the protein was not functional in all the applications used. In histochemical studies of tissues from healthy humans and rats, DAPIT was abundant in insulin-sensitive tissues employing aerobic metabolism and in epithelium actively transporting nutrients and ions. In insulin-sensitive tissues of diabetic rats DAPIT was over-expressed in myocardium, skeletal muscle (namely gastrocnemius) and adipose tissue, but down-regulated in the liver compared to healthy rats. In comparison to mice skeletal muscle (calf complex composed of gastrocnemius, soleus and plantaris), no difference in protein expression was seen due to heterogeneity in muscle myofiber types. Finally, in a cell-line over-expressing DAPIT in study III it was shown that an increase at protein level severely impaired the mitochondria by inactivating the ATP-synthase activity regardless of active respiration of the cells. As a consequence, the mitochondria produced reactive oxygen species (ROS), which most likely up-regulated transcription factors, further regulating anaerobic metabolism and cell dedifferentiation. As a result, the epithelial type of cells transformed into mesenchymal-like and decelerated its proliferation rate. Searches in databases implicated DAPIT over-expression as being abundant in various cancer cell lines, suggesting that it could function as an oncogene when over-expressed in the presence of insulin. The studies in this series enabled the discovery and characterization of a novel protein, DAPIT, in insulin-deficient diabetes. Its expression at cellular and tissue level in healthy and diabetic humans and rodents was characterized with a custom-made antibody. DAPIT over-expression diminished the activity of the energy-producing ATP-synthase, thereby regulating cellular metabolism to the point of aerobic glycolysis and disappearance of the epithelial characteristics of the studied cell line. As a consequence, the dedifferentiated cells showed several features of cancer stem cells, which are discussed. In addition to the DAPIT over-expressing cell line and type 1 diabetes, this over-expression, according to literature and databases, was also seen in Parkinson’s disease, multiple sclerosis (MS), high weight gain, cardiac hypertrophy and arsenic-related toxicity. These findings suggest that DAPIT over-expression could be a more common phenomenon in regulating ATP-synthase and inactivity of oxidative phosphorylation in diseases where metabolic disturbances play a significant role, for example diabetes, cancer, degenerative, autoimmune, toxin and epigenetically regulated conditions. The knock-in mouse recognizing the pathologic changes in question would be of help in understanding the consequences of mitochondrial impairments due to DAPIT over-expression