Molecular Consequences of Gene Amplification in Breast Cancer

Rintasyöpä on teollisuusmaiden naisten yleisin syöpämuoto ja koskettaa n. joka kahdeksatta naista heidän elinaikanaan. Rintasyöpä saa alkunsa solun perimäaineksen, DNA:n, muutoksista. Näiden DNA vaurioiden seurauksena solun kasvua edistävien syöpägeenien toiminta solussa voimistuu eli aktivoituu, kun taas solujen kasvua hillitsevien ns. kasvurajoitegeenien toiminta heikkenee. Muuttunut solu saavuttaa kasvuedun ja alkaa jakautua normaalisoluja nopeammin. Rintasyövässä syöpägeenien yleisin aktivoitumismekanismi on geenin monistuminen. Tähän mennessä tunnetuista rintasyövän geenimonistumista kliinisesti merkittävin on ERBB2-geenin monistuma, jota esiintyy n. 10-30 % rintasyövistä. Väitöskirjan ensimmäisessä ja toisessa osatyössä keskityttiin selvittämään ERBB2 geenimonistuma-alueen rakennetta ja tunnistamaan tältä alueelta uusia monistumalla aktivoituneita syöpägeenejä. Osoitimme, että monistuman ydinalue rajautuu 280 kb alueelle, jolta voidaan tunnistaa kymmenen geeniä niiden koodittamien lähetti-RNA-tuotteiden perusteella. Näistä geeneistä kuudella, ERBB2 mukaan luettuna, ilmentymistaso oli tilastollisesti merkittävästi kohonnut rintasyövässä vaikuttaen siten mahdollisesti ko. syövän kulkuun. ERBB2-geenimonistuman on aiemmin osoitettu olevan kliinisesti merkittävä, sillä sen esiintyminen on yhteydessä potilaiden huonoon ennusteeseen ja taudin uusiutumiseen. Hiljattain ERBB2 geenin koodaaman proteiinin toiminnan estämiseen kehitettiin spesifinen lääkeaine, Herceptin, jota käytetään ERBB2 geenin monistuman omaavilla potilailla. Tällä hetkellä Herceptin hoidon ja erityisesti hoitovasteissa havaittujen yksilöllisten erojen tuntemus on vielä puutteellista. Osatyössä III tarkastelimme Herceptin-hoidon vaikutuksia geenien ilmentymiseen koko genominlaajuista cDNA mikrosiruanalyysiä käyttäen. Tunnistimme joukon geenejä (439 geeniä), joiden ilmentymistaso oli sidoksissa ERBB2-monistuman olemassaoloon tai vastaavasti sen puuttumiseen. Toiminnaltaan nämä geenit edustivat useita keskeisiä biologisia prosesseja, kuten RNA:n muokkaus, DNA:n virheiden korjaus, solujen kiinnittyminen ja solujen kasvun säätely. Tulokset osoittivat myös, että rintasyövässä ERBB2 geenin ilmentymisasteella saattaa olla tärkeä merkitys Herceptin-hoidon vastetta ennustettaessa. ERBB2-geenimonistuma-alueen ohella rintasyövässä on tunnistettu useita muita monistuma-alueita kromosomaalista vertailevaa genomista hybridisaatiota (CGH) käyttämällä. Kuitenkin näiden monistumien geenitason vaikutuksista on vielä niukasti tietoa. Osatyössä IV käytimme aiempaa herkempää cDNA-mikrosiruun pohjautuvaa CGH-menetelmää, joka mahdollisti monistumien tarkemman kartoituksen sekä monistuma-alueilla sijaitsevien geenien ilmentymisen samanaikaisen määrityksen. Tämän menetelmän avulla tunnistimme 24 erillistä rintasyövän monistuma-aluetta eri puolelta genomia. Näiden joukossa oli mm. kaksi ennen kuuvaamatonta monistuma-aluetta kromosomeissa 9p13 ja 17q21.3. Samanaikaisen geenien ilmentymistasojen määrityksen avulla pystyimme tunnistamaan monistuma-alueilta yhteensä 270 geeniä, joiden ilmentyminen oli johdonmukaisesti kasvanut geeni-monistuman seurauksena. Yhteenvetona tutkimuksessa tunnistettiin useita monistumalla aktivoituneita geenejä, jotka ovat mahdollisesti osallisena rintasyövän synnyssä ja etenemisessä. Jatkotutkimuksissa keskitymme selvittämään näiden geenien toimintaa rintasyövässä.cDNA microarray technology was applied for a systematic survey of gene copy numbers and gene expression levels at the ERBB2 amplicon at 17q12. For this purpose a chromosome 17-specific cDNA microarray containing 217 clones from this region was constructed and used for parallel analysis of gene copy numbers and gene expression levels in seven breast cancer cell lines. Direct comparison of data from these two array-based analyses allowed identification of a small set of transcripts showing a consistent pattern of increased copy number and overexpression in the 17q12 amplified cell lines. Detailed characterization of the structure and extent of the 17q12 amplicon was performed using large insert size BAC clones and interphase fluorescence in situ hybridization (FISH). The amplicon mapping revealed a minimal common region of amplification that was restricted to a single BAC clone both in breast cancer cell lines and in primary breast tumors. This 280 kb minimal region contains ten transcripts, eight representing known genes and two encoding uncharacterised hypothetical proteins. The molecular consequences of amplification in primary breast tumors were determined using real time RT-PCR. Expression analysis identified six genes (ERBB2, GRB7, PNMT, MLN64, MGC9753, MGC14832) showing statistically highly significant correlation between gene copy number and expression levels. Global effects of Herceptin treatment on gene expression levels in ERBB2 amplified and non-amplified cell lines were explored using cDNA microarrays. In growth inhibition assays, Herceptin treatment induced a dose-dependent growth reduction in ERBB2 amplified breast cancer cell lines whereas non-amplified cell lines showed only a minimal effect. Using a step-wise gene selection algorithm a set of 439 genes that best separated the amplified and non-amplified cell lines from each other was identified. The discriminatory power of these genes was validated by both hierarchical clustering and self-organizing map analyses. In the ERBB2 amplified cell lines, Herceptin treatment induced the expression of several genes involved in RNA processing and DNA repair, while expression of cell adhesion mediators and known oncogenes such as c-FOS and c-KIT was downregulated. To explore the molecular consequences of gene amplification on a global level, a genome-wide gene copy number and expression analysis was performed in 14 breast cancer cell lines using a cDNA microarray containing 13,824 clones. High-resolution CGH microarray analysis identified 24 independent amplicons ranging in size from 0.2 to 12 Mb. Both low- and high-level copy number increases had a considerable effect on gene expression levels throughout the genome. Of the most highly amplified genes, 44 % showed overexpression whereas 10.5 % of the highly overexpressed genes were amplified. Statistical analysis with random permutation tests revealed a set of 270 genes whose expression levels were systematically attributable to gene amplification status. These included many previously described amplification target genes as well as several genes not previously shown to have a role in breast cancer