Cellular Functions of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Nef Protein

Nef on HIV-1:n ja HIV-2:n sekä apinoiden lähisukuisten SI-virusten säätelyproteiini, jolla on tärkeä rooli näiden virusten aiheuttaman immuunikadon (AIDS) patogeneesissä. Vaikka HIV/SIV lisääntyy useimmissa soluviljely-olosuhteissa myös ilman Nef-proteiinia, on infektion eteneminen AIDS-vaiheeseen merkittävästi hidastunut, miltei pysähtynyt, apinoissa tai potilaissa, jotka ovat infektoituneet viruksilla, joista puuttuu toimiva Nef-proteiini. Nef-proteiinille on kuvattu useita solutason vaikutuksia, kuten HIV:n reseptorin, CD4-molekyylin, poistaminen solun pinnalta. Toinen Nef-proteiinin tunnetuista vaikutuksista on solussa tuotettujen uusien virusten infektiokyvyn lisääminen. Lisäksi Nef:in on osoitettu vaikuttavan solunsisäiseen viestintään. On edelleen kuitenkin epäselvää, mitkä ovat ne tärkeät Nef-proteiinin tehtävät solutasolla, jotka edesauttavat viruksen lisääntymistä infektoituneissa potilaissa. Nef:in on osoitettu sitoutuvan moniin solun proteiineihin, joista monet ovat erityisesti soluaktivaatioon johtavien viestintäreittien osasia. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli selvittää miten Nef vaikuttaa HIV-infektion kannalta tärkeään T-solu-aktivaatioon ja mitkä ovat ne molekyylitason mekanismit, joilla Nef aikaansaa nämä vaikutukset. Tavoitteena oli myös tutkia Nef:in vuorovaikutuksia solun proteiinien kanssa pyrkimyksenä selvittää mitkä proteiinit sitoutuvat Nef:iin ja millä tavoin. Tässä työssä olemme karakterisoineet Nef:iin sitoutuvan kinaasin ja osoittaneet sen olevan PAK2. Edelleen selvitimme mitkä osat Nef- ja PAK2-proteiineista tarvitaan niiden sitoutumiseen toisiinsa. Nämä havainnot ovat tärkeitä jatkossa selvitettäessä millä tavalla Nef- ja PAK2-proteiinien vuorovaikutus liittyy Nef:in taudinkulkua edistäviin toimintoihin. Toinen tämän työn päähavainnoista oli uuden Nef:n T-solujen viestintämekanismeja muokkaavan toiminnon löytyminen. Tutkimuksemme osoittivat että Nef aktivoi T-soluissa kalsium-välitteisen viestintäreitin. Selvitimme molekyylitasolla miten Nef aikaansaa tämän reitin aktivaation. Aikaisemmista epäilyistä poiketen, Nef ei vaikuttanut suoraan T-solureseptorin toimintaan vaan aktivoi kalsium-välitteisen viestintäreitin myöhäisemmällä tasolla sitoutumalla IP3R-molekyyliin. Havainto voi osaltaan selittää miten Nef kiihdyttää HI-viruksen lisääntymistä T-soluissa, ja tarjoaa myös uuden näkökulman solunsisäisen kalsium-viestinnän mekanismien tutkimiseen. Nef:in toimintamekanismien tunteminen myös edesauttaa uudentyyppisten HIV-lääkkeiden kehittämistä.Nef is a 25-34kDa accessory protein of the primate lentiviruses (HIV-1/2 and SIV). Despite being dispensable for viral life cycle in most transformed cell lines, Nef has an essential role in vivo by promoting efficient viral replication and subsequent evasion of host immune defence to develop AIDS. Several cellular functions of Nef have been described, downregulation of the surface expression of CD4 and major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules, enhancement of viral replication kinetics as well as the intrinsic infectivity of HIV particles. In addition, Nef has been shown to modulate cellular signal transduction pathways, an effect that per se might contribute to the above-mentioned functions of Nef. Although Nef seems to exert its effects by interacting with cellular host proteins, the mechanisms have not yet been fully elucidated at molecular level. The purpose of this work was to set up model systems and use them to study the effects of Nef on cellular signaling pathways, especially in T-cells. Another goal was to characterize Nef-interacting cellular proteins and the molecular mechanisms of such interactions in order to assess their relevance for Nef functions. In the present study we have identified a previously described Nef-associated cellular serine/threonine kinase (NAK) as p21-activated kinase 2 (PAK2) and characterized the structural and functional features required for their interaction. Our data showed that the SH3-binding domain was required and implicated also another surface of Nef in mediating association with PAK2. Because PAK2 does not contain any SH3 domains we concluded that an additional SH3-containing component is likely to participate in formation of the Nef/PAK2-complex. The identification of NAK as PAK2 facilitates the studies aiming to understand the mechanistic role of NAK for Nef-mediated effects on viral pathogenicity. To this end, we showed that an intact CRIB-motif in PAK2, important for PAK activation, was required and that Nef specifically associated with a highly active small subpopulation of PAK2. The other main area of investigation was the effect of Nef on T-cell activation. We found a novel function of Nef that was conserved among divergent Nef alleles thus suggesting an important role for this function in vivo. Nef activated the Ca2+/calcineurin signaling in a manner that was independent of T-cell receptor proximal events but required inositol triphosphate receptor function. Consequently, Nef-mediated activation of calcium signaling was strongly synergistic with activation of the RAS/MAPK-pathway in induction of NFAT-driven transcription. Additionally, protein kinase C-q (PKCq) was implicated as a possible physiological cofactor for Nef in NFAT activation. Furthermore, by employing a mutagenesis study of Nef, we found that an intact SH3-binding domain, membrane targeting and residues implicated in PAK2 binding and oligomerization of Nef, were required for this function. The finding that Nef participates in NFAT activation could be highly relevant for the capacity of Nef to enhance viral replication. Clearly, development of biological models to study this feature of Nef in viral context is extremely important. In addition to its impact on HIV studies, our observation that Nef activates Ca2+-influx without apparent depletion of the intracellular Ca2+-stores provides new insights into studies addressing the role of IP3R in mediating capacitative Ca2+ entry