Structural and functional characterization of rhizavidin, bradavidin II and xenavidin; new members of the avidin family and the Calycin superfamily

Uudet uljaat avidiinit Kananmunan valkuaisesta eristetty avidiini ja sen bakteerista löydetty vastine, streptavidiini, ovat biotiinia (tunnetaan myös H-vitamiinina) erittäin tiukasti sitovia valkuaisaineita eli proteiineja. Tämä on tiukin luonnossa tunnettu heikkoihin kemiallisiin vuorovaikutuksiin perustuva sitoutuminen. Avidiini ja streptavidiini [lyhennettynä (strept)avidiini] kestävät erittäin happamia ja emäksisiä oloja sekä korkeita lämpötiloja, mikä on useimmille proteiineille epätavallista. Biotiinin sitoutuminen (strept)avidiiniin parantaa kestävyyttä entisestään. Ne koostuvat neljästä samanlaisesta alayksiköstä, jotka ovat tynnyrimallisia ja joista jokainen voi sitoa yhden biotiini molekyylin. (Strept)avidiinit säilyttävät rakenteensa ja toimintansa hyvin geneettisessä muokkauksessa. Kaikki nämä ominaisuudet ovat johtaneet (strept)avidiinien laajaan käyttöön erilaisissa käytännön sovelluksissa bioteknologiassa ja lääketieteessä. (Strept)avidiinien käyttöön liittyy myös haittapuolia. Ne ovat osaan sovelluksista melko suuria koostuessaan neljästä alayksiköstä ja biotiinin irrottaminen niistä on käytännössä lähes mahdotonta. (Strept)avidiineja on käytetty syöpähoidoissa kuljettamaan terapeuttisia aineita syöpäsoluihin. Vaikka erittäin lupaavia tuloksia on saatu, ne aiheuttavat vakavia immunologisia reaktioita potilaille, mikä rajoittaa niiden tehokasta uudelleenkäyttöä. Väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia kolmea uutta avidiinin kaltaista proteiinia, niiden rakennetta ja toimintaa sekä niiden mahdollista bioteknologista käyttöä. Kaksi uusista proteiineista on peräisin bakteereista (Rhizobium etli ja Bradyrhizobium japonicum) ja yksi sammakosta (Xenopus tropicalis). Proteiinit tuotettiin joko bakteerissa (E. coli) tai hyönteissoluissa (S. frugiperda) ja eristettiin affiniteettikromatografialla. Niiden biotiinin ja biotiinivastineiden sitomista ja irtoamista sekä lämmön ja proteaasin kestävyysominaisuuksia tutkittiin käyttäen laajasti biokemian ja biofysiikan menetelmiä. Lisäksi tutkittiin niiden immunologisia ominaisuuksia potilasvasta-aineiden avulla. Uudet avidiinit, jotka nimettiin alkuperänsä mukaan rhizavidiiniksi, bradavidiini II:ksi ja xenavidiiniksi, ovat rakenteeltaan avidiinin kaltaisia ja sitovat tiukasti biotiinia. Yksi tärkeimmistä havainnoista on se, että rhizavidiini muodostuu vain kahdesta samanlaisesta alayksiköstä neljän sijaan. Se onkin ensimmäinen dimeerinen proteiini avidiinien joukossa. Toinen merkittävä löydös on se, että rhizavidiinilta ja bradavidiini II:lta puuttuu eräs aminohappo (tryptofaani), joka on tiukan biotiinin sitomisen kannalta yksi tärkeimmistä. Vaikka uusien avidiinien biotiinin sitomiskyky on hieman heikompi kuin (strept)avidiinin, on se riittävä useimpia bioteknologisia sovelluksia ajatellen. Uudet avidiinit ovat myös hyvin kestäviä (strept)avidiinien tavoin, vaikka niiden lämmönsietokyky onkin hieman heikentynyt. Tärkeää on, että uudet avidiinit ovat immunologisesti erilaisia, eivätkä potilasvasta-aineet avidiinia tai streptavidiinia vastaan tunnista niitä. Tästä syystä uudet avidiinit tarjoavat uusia käyttömahdollisuuksia esimerkiksi kohdennetussa lääkehoidossa. Dimeerisenä proteiinina rhizavidiinia voitaisiin käyttää niissä sovelluksissa, missä tetrameerinen avidiini on liian suuri, mutta tarvitaan kuitenkin tiukkaa biotiinin sitoutumista. Uusia avidiineja voitaisiin käyttää myös silloin, kun biotiini tai biotiinianalogi pitää irrottaa proteiinista. Väitöskirjatutkimuksessa löydetyt uudet avidiinit luovat mahdollisuuksia jo olemassa olevien sovellusten parantamiseen ja aivan uuden tyyppisten bio- ja nanoteknologisten sovelluksien kehittämiseen. Ne auttavat meitä ymmärtämään paremmin avidiinien tiukkaa biotiinin sitomista ja sen tarkoitusta.Chicken avidin is a tetrameric glycoprotein which has tight (Kd ~10E-15 M) affinity for the small water soluble vitamin, D-biotin. Avidin is exceptionally stable against heat-induced denaturation and protease degradation, and also in a wide range of pH and organic solvents, which offers a basis for the avidin-biotin technology. The avidin family consists of a number of proteins found in the chicken, for example avidin-related proteins (AVRs) and biotin-binding protein A (BBP-A), as well as bacterial streptavidins. Recently novel avidins have been discovered in Gram-negative bacteria such as Rhizobium etli, Bradyrhizobium japonicum, frog Xenopus tropicalis and mushroom Pleurotus cornucopiae. Several other genes for putative new avidins have also been found but remain to be characterized. The objectives of this study were to produce and characterize three novel avidins named rhizavidin, bradavidin II and rhizavidin. The interests focused on the structure and biotin binding capacity of the proteins, and on whether they are avidin-like tetramers and tight biotin binders, as hypothesized based on well conserved amino acid residues which are the most critical for tight biotin binding in (strept)avidin. The most interesting findings were that rhizavidin is a dimer, not a tetramer as are all other avidins so far studied. All three proteins are tight biotin-binding proteins, albeit weaker than avidin. Additionally rhizavidin and tetrameric bradavidin II have no tryptophan identical to the Trp110 in avidin, which is known to be one of the most important residues for tight biotin binding. The thermal stabilities of the new avidins were high, though slightly lower than that of avidin. All three were stable against protease degradation when bound to biotin; rhizavidin was stable also in apo form. (Strept)avidin has been used in medical applications to carry radionuclides and drugs selectively to cancer cells. Promising results have been obtained. However, they may induce severe immunological responses when used more than once with the same patient. New tight biotin-binding avidins not recognized by polyclonal antibodies against avidin or streptavidin would therefore be needed. Such proteins could be employed to carry therapeutics into cancer cells subsequent to (strept)avidin. The novel avidins were shown to have a potential for biotechnological use either in improving existing (nano)biotechnological applications or creating new modes of application