Perfil de metilação e mutação do gene BRCA1 em tumores mamários caninos.

Ministério da Educação, Universidade Federal Rural da Amazônia, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e Conselho Nacional de Conhecimento Científico e Tecnológico.O câncer de mama é a neoplasia de maior prevalência e a principal causa de morbidade e mortalidade entre mulheres do mundo todo. Em cadelas não castradas, tumores mamários são a neoplasia mais freqüentes, com incidência de duas a três vezes superior a observada em mulheres e correspondendo a cerca de 50% dos tumores que acometem caninos. Sabe-se que em mulheres alterações no gene BRCAl são associadas a predisposição genética para o desenvolvimento de neoplasias mamárias. Em contraste com os seres humanos, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que contribuem para o desenvolvimento de tumores em caninos. Sendo assim, o presente estudo objetiva avaliar o perfil de mutação e de metilação do gene BRCAl em tecido mamário canino tumoral e sadio, afim de caracterizar as alterações genéticas e epigenéticas do gene e a possível influência destas na carcinogênese mamária canina. Para isso, foram coletadas amostras de tecido tumoral e sadio de pacientes submetidas a mastectomia no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural da Amazônia. O DNA foi obtido por extração fenólica e submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida de sequenciamento direto, para a análise de mutações nas regiões hotspots do gene BRCAl (Exon 9 - Intron 8 e região 5'UTR). Para a análise de metilação, o DNA foi convertido utilizando o bissulfito de sódio e a região promotora de BRCAl foi analisada por Bissulfile Sequencing PCR. Foram utilizadas amostras teciduais de 24 animais, sendo 17 amostras pareadas (tecido sadio e tecido tumoral) e 7 amostras não pareadas (tecido tumoral), e classificadas histologicamente em tumores de origem mesenquimal ou epitelial. Coletou-se ainda, dados para a caracterização da população, bem como informações sobre histórico reprodutivo dos animais para correlação com os resultados obtidos. Não foi observado hipermetilação na região promotora do BRCAl em nenhuma das amostras analisadas, o que nos leva a sugerir a ausência de envolvimento deste padrão na tumorigênese mamária canina. Para o Exon 9 - Intron 8 foi observada mutação em uma única amostra, caracterizada por uma transição (G>A), ainda não descrita na literatura pesquisada. Os polimorfismos encontrados na região 5'UTR foram caracterizados por duas alterações, uma trasição (T>C) observada em 3 amostras (2 tecido tumoral e 1 tecido não tumoral) não descrita na literatura e observada em pacientes portadores de tipos histológicos de prognóstico desfavorável, e a transição (C>G) observada em 8 amostras (6 tecido tumoral e 2 tecido não tumoral), sendo que esta, quando correlacionada ao histórico dos animais sugere, que a presença do alelo selvagem G favoreça o desenvolvimento tumoral, principalmente em em pacientes jovens independentemente de seu status reprodutivo. Não foi possível caracterizar a importância das mutações no Exon 9 e na região 5' UTR no processo tumoral devido sua baixa freqüência, e portanto mais estudos precisam ser realizados com um maior número amostrai, bem como investigação de outras alterações genéticas e epigenéticas para melhor caracterizar as alterações que favorecem o desenvolvimento de CMTs.Breast câncer is the most common neoplasia and the major contributor to overall morbidity and mortality among women worldwhile. In not spayed female dogs, mammary tumors are the most common neoplasia with an incidence of two to three times superior that related in women and representing about 50% of the tumors affecting this species. In women it is known about the inherited risk for those with mutations in BRCAl to develop mammary tumors. Even less is known about the molecular mechanism that contribute to canine mammary tumors formation. Meanwhile, this research evaluated the whole of mutations and methylation in BRCAl gene, in tumoral and non tumoral tissues of canine mammary glands, and therefore, characterize the genetic and epigenetic alterations in this gene and its influence in mammary carcinogenesis on this specie. Therefore, tumoral and non tumoral samples of canine mammary glands were collected by surgical intervention in the veterinary hospital of Universidade Federal Rural da Amazônia. The DNA was obtained by phenolic extraction and amplified using PCR, followed by direct DNA sequencing, to analyze mutations in hotspots regions in the BRCAl (Éxon 9 - Intron 8 and 5'UTR). For methylation analises, the DNA was converted with bissulfite and the promoter region of BRCAl was analyzed by Bissulfile Sequencing PCR. Samples of 24 animais were analyzed, 17 paired samples (tumoral and non tumoral tissues) and 7 non paired samples (tumoral tissue), classified by its histogenesis in mesenquimal or epitelial tumors. Informations of reproductive history firom the animais were accessed and correlated with the genetic fmdings. Hypermethylation in the BRCAl promoter was not observed in the analyzed samples, suggesting there was no evidence of this mechanism in canine mammary tumorigenesis. In one sample, was observed a mutation in the Éxon 9 - Intron 8 characterized by a transition (G>A), not described in the literature. The polimorfisms in 5'UTR region were characterized by a two changes, a trasition (T>C) observed in 3 samples (2 tumoral e 1 non tumoral tissue) not described in the literature, and observed in patients with histological types of desfavorable prognostic. The transition (OG), was observed in 8 samples (6 tumoral e 2 non tumoral tissues), and when correlated with animais data, suggest that the allele G presence could increase the risk of mammary tumors especially in young female patients independently of its reproductive status. It was not possible to define the importance of the genetic changes in Éxon 9 and 5' UTR region in the CMTs, by its low frequency and therefore, it is necessary more researches, with a higher number of samples, as well as other genetic and epigenetic studies to better recognize the genetic changes participating of the tumorigenesis in CMTs