Characterization of the penicillin-binding proteins in Streptococcus oralis Uo5

In the search for new antibiotics the mechanism behind cell division has been studied for decades. The extensive use of antibiotics has led to the development of resistant bacteria, a problem that has become a global threat. Obtaining a deeper understanding of cell division is essential in the battle against bacteria. In a Gram positive bacteria the cell wall mainly consists of peptidoglycan, which shapes the cell and withstands turgor pressure. The penicillin-binding proteins (PBP) are responsible of generating and cross-linking the glycan strands. The strain investigated is Streptococcus oralis Uo5. The strain has acquired several low-affinity PBPs, which is one of the reasons why Uo5 has gained high resistance levels to penicillin- and cefotaxime. The aim of the study was to characterise the properties of low-affinity PBPs in the high-resistant strain Uo5. The commensal Streptococcus oralis is closely related to the opportunistic pathogen Streptococcus pneumoniae, and their genes are often referred to as mosaic genes, caused by horizontal gene transfer. The PBPs were removed using constructed Janus cassettes, through natural transformation. The growth of all constructed mutants was investigated using a microtiter plate, and β-lactam resistance was determined by using E-test for three different β-lactams. The morphology of the cells was investigated using light microscope, and Bocillin FL assay was executed for detecting active PBPs. One of the main findings in this study suggests that it is possible to remove PBP2b in S. oralis Uo5, which is an essential protein in pneumococcus. The morphology and growth results have however indicated the importance of the low affinity to PBP2b in S. oralis Uo5. Removing pbp2b resulted in decreased resistance in all three tested β-lactams, indicating that some of the high resistance in S. oralis Uo5 is caused by the altered PBP2b. From the results PBP1b and PBP2a seem to be much more sensitive to β-lactams than PBP1a, PBP2x and PBP2b, and contribute little to the overall resistance of the Uo5 strain against Penicillin G, Amoxicillin and Oxacillin. Other important findings were that the deletion of PBP1a was only possible when PBP1b was removed, and the Bocillin FL assay also showed no interaction with PBP1a when PBP1b was removed. The best way to continue this study would be to subject all the 10 mutants to whole genome sequencing in order to verify that they are correctly made and to identify and characterize possible suppressor mutations.Mekanismene bak celledeling har gjennom flere tiår blitt studert, i håp om å finne nye antibiotika. Overdreven bruk av antibiotika har ført til utvikling av resistente bakterier, dette er et problem som har eskalert til å bli en global trussel. Å oppnå en dypere forståelse av celledeling er essensielt for kampen mot resistente bakterier. I en Gram-positiv bakterie er celleveggen hovedsakelig bygget opp av peptidoglykan, som former cellen og motstår osmotisk trykk. De penicillin-bindende proteinene (PBP) er ansvarlige for å generere og kryssbinde glykantrådene. I dette studiet ble stammen Streptococcus oralis Uo5 undersøkt. Stammen har ervervet flere lav affinitets PBPer, og har høy resistens mot penicillin og cefotaxime. Målet med studiet var å karakterisere egenskapene av lav affinitets PBPer i denne resistente S. oralis Uo5 stammen. Den kommensale S. oralis er nært beslektet med den opportunistiske patogene Streptococcus pneumoniae. Genene deres blir ofte kalt for mosaikk gener, som er forårsaket av horisontal genoverføring. Pbp gener ble fjernet ved bruk av konstruerte Janus kassetter, gjennom naturlig transformasjon, og det ble totalt laget . Veksten av alle de konstruerte mutantene ble undersøkt ved bruk av en mikrotiterplate, og β-laktam resistens ble bestemt ved å bruke E-test for tre forskjellige β- laktamer. Morfologien av cellene ble undersøkt ved bruk av lysmikroskop og Bocillin FL assay ble utført for å oppdage aktive PBPer. Et av hovedfunnene i dette studiet antyder at det er mulig å fjerne PBP2b i S. oralis Uo5, som er et essensielt protein i pneumokokker. Morfologien og vekst funnene har derimot indikert viktighetsgraden av den lave affiniteten til PBP2B i Uo5. Fjerning av pbp2b resulterte i lavere resistens i de tre testede β-laktamene, som indikerer at noe av det høye resistensnivået skyldes den altererte PBP2b. Fra resultatet vises det at PBP1b og PBP2a virker mye mer sensitiv for β-laktamer enn PBP1a, PBP2x og PBP2b, og bidrar derfor lite til den totale resistensen mot Penicillin G, Amoxicillin og Oxacillin. Den beste måten å fortsette dette studiet er ved å genomsekvensere alle de 10 lagde mutantene. Dette vil bekrefte om riktig mutant virkelig er laget, og identifisere og karakterisere mulige suppressormutasjoner.submittedVersionM-BIOTE