Salmonid alphavirus infection in Atlantic salmon : viral properties and host responses to infection

Pancreas disease (PD) is a contagious viral disease in salmonid aquaculture in Europe and North America. PD is caused by salmon pancreas disease virus also referred to as salmonid alphavirus (SAV), which belongs to the genus alphavirus within the family Togaviridae. Up to now, at least six subtypes of SAV have been reported. In Norway SAV3 was the only subtype detected in PD diseased fish, but from 2010, a marine variant of subtype 2 has been on an increase, particularly in the Møre and Romsdal and Sør-Trøndelag counties. A better understanding of host-pathogen interactions will provide the basis for improved disease control and vaccine development. Currently, there is one commercial vaccine licensed in Norway and UK/Ireland against PD, based on inactivated whole virus. The efficacy of the vaccine under field conditions has been questioned. In this thesis, the focus was first on the elicited immune response induced by SAV3 infection both in vivo and in vitro. Fish challenged in lab-experiments with SAV3 developed classical, pathological changes as seen under a natural infection. The sequence of pathological changes in the primary target organs, pancreas and subsequently heart, coincides with virus replication levels. Despite a strong innate immune response was detected in the affected organs, the virus infection progressed. The same phenomenon was observed when SAV3 was inoculated onto susceptible cell lines. However, when cells were pre-treated with recombinant IFN-α from 24 to 4 hours prior to infection, viral replication was halted, suggesting the timing of initiation of IFN system is imperative for the antiviral activity. The work was followed by the development of an infectious SAV3 cDNA clone by use of reverse genetics. The constructed cDNA clone containing the full-length genome can be manipulated by deletion, insertion or substitution via genetic engineering. This constitutes a powerful tool for studying viral pathogenesis and developing nucleic acid based vaccines. The recovery of recombinant SAV3 was successful in three different cell lines (CHH-1, CHSE- 214 and BF-2), though the recovery was dependent on the IFN response in the transfected cells. The 6K-deleted cDNA clone failed to generate infectious virus despite production of viral proteins was detected in the cytoplasm. RNA recombination was observed when the 6Kdeleted cDNA was co-transfected into cells together with a helper cDNA encoding all structural genes, resulting in rescued, full-length viral RNA. A SAV3 replicon based vector vaccine was developed and modified by inserting a hammerhead (HH) ribozyme sequence upstream the 5’UTR sequence and incorporating N-terminal 102 nt of capsid gene downstream the internal UTR and upstream the foreign gene. This construct confers a significant increase of the foreign antigen expression. In conclusion, we have established an in vivo infection model of SAV3 and documented the antiviral role of IFN-α against SAV3 replication. We have also produced SAV3 recombinant virus using reverse genetics and a replicon construct for expression of heterologous proteins in fish cells. These tools can be used in future studies of viral pathogenesis and development of future virus vaccine.Pancreas disease (PD) er en smittsom virussykdom hos laksefisk i akvakultur i Europa og Nord-Amerika. PD er forårsaket av salmon pancreas disease virus (SPDV) også betegnet salmonid alfavirus (SAV), tilhørerende slekten alfavirus i familien Togaviridae. Hittil har minst seks subtyper av SAV (SAV1-6) blitt rapportert, og innenfor disse er SAV3 funnet utelukkende i Norge. Bedre forståelse av vert-agens interaksjoner vil gi grunnlag for bedre sykdomskontroll og danne grunnlaget for vaksineutvikling. For tiden er det en kommersielt tilgjengelig vaksine mot PD, basert på inaktivert hel-virus, men den gir ikke tilfredsstillende beskyttelse i felt. I denne avhandlingen fokuserte vi først på immunresponsen ved SAV3 infeksjon både in vivo og in vitro. Fisk eksperimentelt smittet med SAV3 utviklet klassiske patologiske forandringer lik de vi finner ved naturlige infeksjoner. Rekkefølgen av patologiske forandringer i primære målorganer, bukspyttkjertel og senere hjerte, sammenfalt med nivå av virusreplikasjon. Til tross for at infeksjonen induserte sterke medfødte, immunresponser i affiserte organer, begrenset ikke dette infeksjonen. Det samme så vi når SAV3 ble inokulert på mottakelige cellelinjer. Imidlertid, når cellene ble forbehandlet med rekombinant IFN-α (fra 24 til 4 timer før infeksjon), hindret det replikasjonen av virus. Dette tyder på at tidspunkt for aktivering av IFN-systemet er avgjørende for antiviral aktivitet. Vi etablerte deretter et revers genetikk system for SAV3 slik at vi kunne produsere rekombinant virus fra en cDNA klon som inneholdt (kodet for) hele SAV3 genomet. Dette muliggjør at man senere kan modifisere sekvensen ved å endre, slette eller legge til elemenenter i virusgenomet, for slik å lage virusmutanter. Dette utgjør et svært viktig verktøy når en skal studere egenskaper hos virus, virus patogenese og fremtidig utvikling av DNA baserte vaksiner. Produksjon av rekombinant SAV3 var vellykket i tre forskjellige cellelinjer (CHH-1, CHSE-214 og BF-2 ), selv om effektiviteten varierte avhengig av i hvor stor grad de ulike cellelinjene produserte IFN. Vi forsøkte deretter å lage en attenuert SAV3 stamme uten genet som koder for 6K proteinet. Til tross for at virusets proteiner ble uttrykt i cellenes cytoplasma, klarte vi ikke å produsere rekombinant SAV3 uten 6K. Vi oppdaget derimot at SAV3 viste stor evne til å RNA rekombinasjon. Rekombinasjon ble observert når cDNA kodende for SAV3 uten 6K ble ko-transfektert inn i celler sammen med et hjelpe-cDNA som inneholder kun strukturelle gener (full-lengde). Dette resulterte i hyppig reversjon til fullengde virus. Med utgangspunkt i den infeksiøse cDNA klonene laget vi et SAV3 replicon for uttrykk av heterologe proteiner i cellekultur, og deretter ble effekt av ulike modifiseringer testet. Blant annet undersøkte vi effekten av å sette inn en «hammer-head» (HH) ribozyme sekvens oppstrøms for replikonet. Videre hvordan innlemming av N – terminale deler (102 nt) av kapsid genet nedstrøms for intern UTR og oppstrøms for innsatt fremmed gen gjorde at man fikk et signifikant høyere uttrykk av fremmed protein. Som konklusjonen har vi etablert en in vivo infeksjon modell for SAV3 og dokumentert IFN-α sin viktige antivirale effekt mot SAV3. Vi har videre produsert rekombinant SAV3 virus ved hjelp av revers genetikk samt et SAV replikon konstrukt for uttrykk av heterologt protein i fiskeceller. Disse verktøyene kan brukes i videre studier av virusets patogenese og utvikling av fremtidige virusvaksiner