Regulering av denitrifikasjon i slekten Thauera; respons mønster i overgangen fra oksisk til anoksisk miljø, livet på den energiske kant

Denitrification is a taxonomically widespread process used by more than 60 different genera of bacteria including archaea and some fungi, where nitrate is reduced to dinitrogen gas (N2) by four enzymes; nitrate reductase (NAR & NAP), nitrite reductase (NIR), nitric oxide reductase (NOR) and nitrous oxide reductase (N2OR). The end product of denitrification depends on the different bacteria species ability to synthesize the required enzymes involved in the denitrification process, some bacteria drive this process all the way to dinitrogen gas because they retain the genes necessary for the synthesis of all the four enzymes involved, while some only to N2O and others emit a mixture of both N2O and N2 to the atmosphere. The release of the intermediates NO and N2O are frequently observed in the denitrification process, when excess reactive nitrogen causes an overload of the enzymatic system, a phenomena known as “hole in the pipe”. N2O is a very potent greenhouse gas (300 times more than CO2) with a residence time of up to 120 to 150 years in the atmosphere. Both NO and N2O destroys the ozone layer, which protects us by absorbing and reflecting unwanted radiation and ultraviolet light. Several of the greenhouse gases have increased greatly since the preindustrial era up to today, and a large proportion of this increase is due to human activities. The studies of a few model organisms have given insight in some of the phenotypic and genotypic regulation of denitrification, but more research is need to get a better understanding of why different bacteria that share similar genotypic traits displays a large variety of different phenotypic characteristics. Little is known about the phenotypic characteristics of Thauera during denitrification, mainly because this is not a model organism. The genera Thauera are found within the β-subdivision of Proteobacteria, capable of switching to denitrification, and use nitrate, nitrite or NO as electron acceptor when oxygen in the environment is scarce, while emitting either only N2 or a combination of the gases NO, N2O and N2 depended on which reductase the bacteria is able to express. Two different methodological approaches were utilized in hope of getting a better understanding of Thauera linaloolentis phenotypic characteristics during denitrification. The two gas kinetic experiments performed on the robotized incubation system, showed that Thauera linaloolentis performed a balanced transition from oxic to anoxic respiration at 3 neutral pH, with very low concentrations of NO (1-15 nM) and moderate concentrations of N2O (40-31700 nmol). N2O however displayed a tendency to increase in concentration with increased initial oxygen. The results obtained from electron flux showed that with higher initial oxygen, lower were the number of cells that managed the transition from oxic to anoxic respiration, but the fraction that managed the transition was still high even at 7% initial oxygen. To verify the results obtained on the robotized incubation system, another experiment was performed where nalidixic acid was used for the quantification of growing cells by microscopic count. The result from this experiment revealed that the fraction of T. linaloolentis that managed the transition was indeed high (84, 77 and 73%), but decreased with increased initial oxygen concentrations. The study has provided new insight in Thauera linaloolentis phenotypic characteristics during denitrification, which was only speculated upon earlier. Denitrifikasjon er en taksonomisk utbredt prosessen brukt av mer enn 60 forskjellige arter av bakterier, inkludert Archaea og noen sopper, hvor nitrat blir redusert til dinitrogen gass (N2) av fire enzymer; nitrat reduktase (NAR & NAP), nitritt reduktase (NIR), NO reduktase (NOR) og N2O reduktase (N2OR). Sluttproduktet av denitrifikasjon for de ulike bakterier artene avhenger av evnen til å syntetisere de nødvendige enzymene involvert i denitrifikasjon prosessen, noen bakterier drive denne prosessen helt til dinitrogen gass fordi de har genene som kreves for å syntetisere alle fire involverte enzymene, mens noen bare til N2O og andre avgir en blanding av både N2O og N2 til atmosfæren. Utslipp av intermediatene NO og N2O er ofte observert i denitrifikasjon prosessen, skjes når store mengder reaktivt nitrogen overbelaster det enzymatiske systemet, et fenomen kjent som "hull i røret". N2O er en svært potent drivhusgass (300 ganger mer enn CO2) med en oppholdstid på opp til 120 til 150 år i atmosfæren. Både NO og N2O ødelegger ozonlaget, som beskytter oss ved å absorbere og reflektere uønsket stråling og ultrafiolett lys. Flere av klimagasser har økt kraftig siden den preindustrielle epoken og en stor andel av denne økningen skyldes menneskelig aktivitet. Studier av noen få modellorganismer har gitt innblikk i noen av de fenotypiske og genotypiske reguleringene av denitrifikasjon, men mer forskning er nødvendig å få en bedre forståelse av hvorfor ulike bakterier som deler lignende genotypiske trekk viser et stort utvalg av forskjellige fenotypiske egenskaper. Lite er kjent om de fenotypiske egenskapene til Thauera under denitrifikasjon, hovedsakelig fordi dette ikke er en modell organisme. Thauera slekten finnes innenfor β-subdivision av Proteobacteria, i stand til å bytte til denitrifikasjon, og bruke nitrat, nitritt eller NO som elektron akseptorer når det er veldig lite oksygen igjen i miljøet, med utslipp av enten bare N2 eller en kombinasjon av gassene NO, N2O og N2 avhengig av hvilke reduktase bakteriene er i stand til å uttrykke. To forskjellige metodiske tilnærminger ble brukt i håp om å få en bedre forståelse av Thauera linaloolentis fenotypiske egenskaper under denitrifikasjon. To gass kinetikk eksperimenter ble utført på et robotisert inkubasjonssystem, som viste at Thauera linaloolentis utførte en balansert overgang fra oksisk til anoksisk respirasjon ved nøytral pH, med svært lave konsentrasjoner av NO (1-15 nM) og moderate konsentrasjoner av N2O (40-31700 nmol). N2O imidlertid vist en tendens til å øke i konsentrasjon ved økt 5 innledende oksygen. Resultatene hentet fra elektron fluks viste at ved høyere innledende oksygen, førte til at et lavere antall celler klarte overgangen fra oksisk til anoksisk respirasjon, men den fraksjonen som klarte overgangen var fortsatt svært høy selv ved 7% innledende oksygen. For å bekrefte resultatene innhentet på det robotiserte inkubasjonssystemet, ble et annet eksperiment utført der nalidixic acid ble brukt til kvantifisering av voksende celler som ble senere telt i et mikroskop. Resultatet fra dette eksperimentet viste at andelen av T. linaloolentis som klarte overgangen var virkelig høy (84, 77 og 73%), men reduseres ved økt innledende oksygen konsentrasjon. Studien har gitt ny innsikt i Thauera linaloolentis fenotypiske egenskaper under denitrifikasjon, som tidligere var bare spekulert på