Human Efflux Transporters in Drug Disposition : in vitro Transport of Glucuronide Metabolites

Drug metabolism and transport are key areas in the drug development and therapy. The fate of a drug in the human body is determined by its physicochemical properties, which affect its absorption, distribution, metabolism and elimination processes within the body. The same processes also affect disposition of drug metabolites. Glucuronidation is the most important drug metabolism reaction besides oxidations. Glucuronidation of a drug produces glucuronic acid conjugates that are too hydrophilic to freely permeate cell membranes, and thus they require active transporters for their excretion. Knowledge of disposition of drug metabolites in humans is important for comprehensive understanding of the drug-related effects within the body. For example, glucuronide conjugates of some drugs inhibit drug-metabolizing enzymes and transporters, which causes drug-drug interactions in humans. Therefore, investigations of the molecular mechanisms of drug metabolite excretion are needed. Hepatic and intestinal ATP-dependent efflux transporters multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2, ABCC2), MRP3 (ABCC3), MRP4 (ABCC4) and breast cancer resistance protein (BCRP, ACBG2) have been identified to transport glucuronide metabolites of drugs in animal experiments and human in vitro assays. However, systematic studies that compare the properties of these human transporters and characterize their transport kinetics are often lacking. In this thesis, the transport activity of human MRP2-MRP4 and BCRP was evaluated for 18 different glucuronide conjugates of drugs and drug-like compounds, such as androgens and estrogens. The major findings were that MRP2 and MRP3 are rather non-selective transporters and accept most of the glucuronides investigated as their substrates. MRP4 and BCRP, on the other hand, exhibit rather selective transport and these transporters were active only toward some of the glucuronides that were tested in this thesis. P-glycoprotein (P-gp, ABCB1), another important drug efflux transporter, was also included in the assays. However, this transporter did not transport any of the glucuronides investigated. Transport kinetic analyses revealed low Km values for MRP3, mostly clearly below 100 μM. This indicates that MRP3 is a high affinity transporter for glucuronide metabolites in the liver and intestine, where it is highly expressed. The Km values of MRP2 ranged from 120 to 800 μM. These values suggest that MRP2 is a low affinity, but possibly a high capacity, transporter in the same tissues as MRP3. MRP4 and BCRP exhibited Km values between 3-170 μM and 10-80 μM, respectively. In conclusion, MRP2, MRP3, MRP4 and BCRP are important efflux transporters that affect disposition of glucuronide metabolites of drugs in the human body. The affinity of glucuronides to these transporters may determine the different excretion of these drug metabolites in vivo, in either urine or bile.Lääkeaineet, muut vierasaineet sekä elimistön omat pienimolekyyliset välittäjäaineet kuten steroidit erittyvät elimistöstä virtsaan tai ulosteisiin yleensä aineenvaihduntatuotteinaan. Tämän takia on tärkeä tutkia lääkeaineiden erittyminen ja aineenvaihdunta lääkeainekehityksessä. Konjugaatio glukuronidihapon kanssa on tärkein aineenvaihduntareaktio lääkeaineille heti hapettumisreaktioiden jälkeen. Lääkeaineiden glukuronidi-konjugaatit eli glukuronidit eivät pysty läpäisemään solukalvoja vapaasti muodostumisensa jälkeen, vaan solukalvoilla sijaitsevat aktiiviset kuljetinproteiinit poistavat näitä aineenvaihduntatuotteita maksan, suoliston ja munuaisten soluista. Glukuronidien on osoitettu esimerkiksi estävän muiden lääkeaineiden aineenvaihduntaa. Tämän takia on tärkeä tutkia lääkeaineiden aineenvaihduntatuotteiden, kuten glukuronidien, poistuminen elimistöstä, eikä pelkästään tutkia itse lääkeaineen poistumista ja aineenvaihduntaa. Maksan, suolen sekä munuaisten solukalvoilla esiintyvien kuljetinproteiinien MRP2 (ABCC2), MRP3 (ABCC3), MRP4 (ABCC4), BCRP (ABCG2) sekä P-gp (ABCB1) tiedetään osallistuvan lääkeaineiden glukuronidien kuljetukseen eläimillä. Kyseisillä ihmisten kuljetinproteiineilla ei ole kuitenkaan tehty laajoja solukokeita, joissa verrattaisiin näiden proteiinien toimintaa keskenään toisiinsa sekä määritettäisiin niiden kuljetuskinetiikkaa. Tässä väitöstutkimuksessa tutkittiin solukokeilla yllä mainittuja kuljetinproteiineja käyttäen yhteensä 18:ta eri lääkeaineiden tai vastaavien rakenteiden, kuten estrogeenien tai androgeenien, glukuronidia. Tutkimuksen päälöydöksenä havaittiin, että MRP2 ja MRP3 ovat suhteellisen epäselektiivisiä kuljetinproteiineja, jotka kuljettivat lähes kaikkia tutkittuja glukuronideja. MRP4 ja BCRP ovat puolestaan huomattavasti selektiivisempiä, ja ne kuljettivat vain osaa tutkituista yhdisteistä. P-gp ei kuljettanut yhtäkään tutkituista glukuronideista. Kuljetuskinetiikkakokeissa havaittiin, että MRP3:n kuljetus on yleensä suuri tehoista matalilla glukuronidien pitoisuuksilla, kun taas MRP2 kuljettaa tutkittuja yhdisteitä paremmin niiden suurilla pitoisuuksilla. MRP4:n ja BCRP:n kuljetuskinetiikkatulokset asettuivat MRP2:n ja MRP3:n väliin. Yhteenvetona voidaan todeta, että MRP3 vastaa lääkeaineiden glukuronidi-aineenvaihduntatuotteiden kuljetuksesta niiden pienillä pitoisuuksilla maksassa ja suolistossa, kun taas MRP2 on tärkeämpi suurilla pitoisuuksilla. MRP4 ja BCRP ovat merkittäviä tiettyjen lääkeaineiden glukuronideille. Nämä neljä kuljetinproteiinit yhdessä määrittävät lääkeaineiden aineenvaihduntatuotteiden erittymisen pois ihmiselimistöstä joko virtsaan tai ulosteeseen