Adenosinergic system and BDNF mediated-signalling in heterozygous females of a Rett syndrome mouse model

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019A síndrome de Rett (RTT) é uma doença genética rara que afeta o neurodesenvolvimento. A incidência da RTT é de 1 em cada 10000 indivíduos do sexo feminino. A ocorrência de RTT em indivíduos do sexo masculino é rara e inicialmente a ausência de rapazes com RTT na sua forma clássica levou a que se considerasse a doença como letal nestes indivíduos. No entanto ao longo da literatura têm sido documentados casos de pacientes do sexo masculino que apresentam RTT na sua forma clássica. Estes indivíduos acabaram por ser categorizados em grupos: 1) casos esporádicos de indivíduos do sexo masculino que cumprem os critérios de inclusão da RTT, 2) portadores da síndrome de Klinefelter, 3) indivíduos que têm mosaicismo para o gene causador da RTT, 4) indivíduos do sexo masculino com encefalopatia severa pertencentes a famílias com RTT. A RTT está tipificada por um aparente desenvolvimento normal durante os primeiros 6 a 18 meses de idade. Após este período de tempo segue-se uma fase de regressão na qual as capacidades até então adquiridas são perdidas. Entre os vários sintomas que caracterizam esta síndrome destacam-se: a perda da capacidade motora, estereotipias das mãos e a perda da funcionalidade das mesmas, epilepsia, perturbações cognitivas, bruxismo, escoliose e a presença de comportamentos exibidos no espectro do autismo. Esta doença é, em pelo menos 90% dos casos, causada por mutações no gene MECP2 (methyl CpG binding protein 2) que se encontra localizado no cromossoma X. Este gene codifica a proteína MeCP2 que assume funções no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Esta proteína é responsável pela regulação da expressão génica, em particular do gene do fator neurotrófico derivado do cérebro (Brain-derived neurotrophic factor - BDNF). O BDNF é um fator neurotrófico que, pela ativação do recetor TrkB-FL promove a plasticidade sináptica, desenvolvimento, proliferação e sobrevivência neuronais. Os níveis de BDNF em modelos animais de murganho com RTT estão diminuídos. Adicionalmente a quantificação dos níveis de mRNA de BDNF em pacientes com RTT também é menor do que em indivíduos saudáveis. Tendo em conta a disfunção da sinalização mediada pelo BDNF na RTT, diferentes estratégias têm sido tentadas para aumentar os níveis de BDNF no cérebro de modelos animais com RTT. Contudo, a impermeabilidade da barreira hematoencefálica ao BDNF dificulta o uso desta neurotrofina enquanto estratégia farmacológica. Deste modo, de forma a potenciar os efeitos do BDNF, têm sido investigadas alternativas envolvendo por exemplo o uso de fármacos capazes de atravessar a barreira hematoencefálica com a capacidade para facilitarem os efeitos do BDNF. Uma dessas alternativas contempla o uso de agonistas dos recetores da adenosina ou da adenosina, um neuromodulador do Sistema Nervoso Central que exerce a sua ação através da ativação dos recetores A1, A2A, A2B e A3. É, no entanto, a ativação dos recetores A2A (A2AR) que é conhecida como tendo um papel determinante na manutenção e facilitação da sinalização mediada pelo BDNF. Para além da possível importância terapêutica dos A2AR é ainda de salientar o papel inibitório da ativação dos A1R que atua no controlo da excitabilidade sináptica. É interessante verificar que em modelos animais de epilepsia existe uma sobrexpressão da adenosina kinase (ADK) uma das enzimas mais relevantes na regulação dos níveis de adenosina e também níveis reduzidos de adenosina quando por comparação com animais controlo. A sobrexpressão de ADK e uma resultante deficiência de adenosina são suficientes para a ocorrência de crises epilépticas. Por outro lado a inibição de ADK induz um aumento dos níveis de adenosina os quais, pela ativação dos A1R, promovem efeitos anticonvulsivantes. Em conjunto, os dados apresentados demonstram que o sistema adenosinérgico pode ser um potencial alvo terapêutico na RTT. Se por um lado a ativação dos A2AR facilita os efeitos das ações do BDNF, por outro a ativação dos A1R, pelo seu papel inibitório, será relevante em contexto de epilepsia. Tendo em consideração que estas ações promovidas pela adenosina parecem estar afetadas na RTT foram realizados estudos em machos Mecp2 KO que tiveram em conta a avaliação do sistema adenosinérgico nestes animais por comparação com ratinhos saudáveis. Os objetivos desses estudos visavam a caracterização detalhada do sistema adenosinérgico e da sinalização mediada pelo BDNF na RTT. Para o efeito foram usados ratinhos Mecp2 KO e amostras corticais de uma paciente RTT. No nosso laboratório nos machos Mecp2 KO foi encontrado um aumento da expressão dos níveis proteicos dos A1R em homogenatos de córtex cerebral por comparação com ratinhos WT. Quando quantificados por Western Blot os níveis de expressão de A2AR mostraram estar significativamente diminuídos em homogenatos corticais e hipocampais de ratinhos KO. Adicionalmente os registos eletrofisiológicos obtidos através de fatias de hipocampo dos animais apontam para a existência de menores níveis de adenosina endógena. Ao nível da avaliação da sinalização mediada pelo BDNF foram quantificados por ELISA os níveis de expressão proteica desta neurotrofina enquanto que os seus recetores TrkB-FL e TrkB-TC foram quantificados por Western Blot. Os resultados obtidos demonstram que os níveis proteicos de BDNF se encontram diminuídos. Relativamente à quantificação dos recetores foi detetada uma diminuição dos níveis dos recetores TrkB-FL. No entanto, a quantificação da forma trucada, TrkB-TC, não revelou diferenças significativas entre animais WT e animais Mecp2 KO. Adicionalmente foi quantificada a expressão de mRNA para as duas isoformas do recetor TrkB (TrkB-FL e TrkB-TC) no entanto não se registaram diferenças significativas. De modo geral foram então observadas diferenças entre ratinhos machos KO e WT. Em suma verificou-se os resultados obtidos apontam para uma perturbação do sistema adenosinérgico simultânea à desregulação da sinalização mediada pelo BDNF. Classicamente nos estudos com animais RTT têm sido usados principalmente machos Mepc2 KO devido à semelhança do fenótipo deste modelo com a sintomatologia apresentada em humanos. No entanto, considerando que na RTT existe uma grande variabilidade de fenótipos é extremamente relevante estudar o sistema adenosinérgico e a sinalização mediada pelo BDNF em fêmeas heterozigóticas (HET) sintomáticas de ratinho, uma vez que este modelo representa um fenótipo menos severo. Para o efeito foram usadas fêmeas heterozigóticas Mecp2, um modelo bem estabelecido e caracterizado da RTT. Através deste modelo animal procedeu-se à avaliação indireta dos níveis de adenosina através de registos eletrofisiológicos na região CA1 do hipocampo. Adicionalmente foram feitas quantificações proteicas dos A2AR e dos intervenientes na sinalização mediada pelo BDNF por Western Blot. Por fim foram quantificados os A1R através de estudos de ligação. Os níveis de adenosina foram avaliados no hipocampo através do estudo do efeito de agonistas e antagonistas do A1R na transmissão sináptica. Os resultados não revelaram diferenças significativas entre e fêmeas wild-type (WT) e HET sintomáticas (n=5-12). Estudos de ligação mostraram uma tendência para um aumento na densidade proteica de A1R no córtex de fêmeas HET (n=3-4). Através da quantificação por Western Blot foram observados níveis diminuídos de BDNF em homogenatos corticais bem como de A2AR em homogenatos de hipocampo de fêmeas HET (n=5-6). Adicionalmente, foi observada uma tendência para a diminuição de níveis TrkB-FL em homogenatos corticais de fêmeas HET (n=6). De modo geral, os resultados apontam para uma alteração no sistema adenosinérgico e na sinalização mediada pelo BDNF menos acentuada comparativamente à encontrada nos machos KO deste modelo. No entanto estes resultados corroboram que ambos os sistemas se encontram comprometidos na RTT mesmo em casos menos severos de RTT como os tipificados pelas fêmeas HET. Estes resultados colocam o sistema adenosinérgico como um exequível alvo terapêutico a abordar no futuro. Possíveis estratégias terapêuticas para a RTT considerando o sistema adenosinérgico poderão ter em conta terapias que levem ao aumento da adenosina.Rett syndrome (RTT) is a neurodevelopmental disorder that in at least 90% of the cases is caused by mutations in the MECP2 gene. The MeCP2 protein regulates gene expression, such as Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) gene. BDNF is a neurotrophic factor that through the activation of TrkB-FL receptor promotes, among other effects, synaptic plasticity. BDNF levels are decreased in RTT mouse models. Additionally, lower BDNF mRNA levels were seen in autopsy brain samples from humans with RTT. Therefore, several approaches have been used to increase BDNF expression in the brain, however the inability of BDNF to cross the blood-brain barrier makes it difficult to use as a pharmacological therapy. It is known that A2AR activation facilitates BDNF actions. In our lab we have been developing a novel strategy to potentiate BDNF actions through the activation of adenosine A2AR. We found an impairment in the adenosinergic system, in male Mecp2 KO mice, simultaneously to the deregulation of BDNF signalling. The majority of RTT studies use male Mecp2 KO mice because of the similarity with the phenotype of human patients. However since RTT has a range of forms from mild to aggressive it is important to study the adenosinergic system and the BDNF signalling in heterozygous females (HET) of the RTT mice model which represent the mild forms. Hippocampal adenosine levels were evaluated by studying the effect of A1R agonists and antagonists on synaptic transmission. The results revealed no significant differences between WT and HET females (n=5-12). Radioactive binding studies showed a tendency for a higher density of A1R in the cortex of HET females (n=3-4). Western Blot revealed diminished BDNF levels in the cortex and diminished A2AR levels in the hippocampus of RTT females (n=5-6). Additionally we detected a tendency to a decrease in the levels of cortical TrkB-FL receptors of HET females (n=6). We also quantified other synaptic and myelin related proteins and differences were seen. Overall results point to an impairment in the adenosinergic and the BDNF mediated signalling similarly as occurs in KO males