Study of the effects of the culture condition in the permeation of reconstructed human skin

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A indústria farmacêutica e a indústria cosmética estão entre as que mais investem em pesquisa e desenvolvimento, o que leva ao constante aparecimento de novos fármacos e cosméticos. Todos estes produtos, antes de serem introduzidos no mercado, necessitam de passar por uma avaliação criteriosa relativamente à sua eficácia e toxicidade, pois podem provocar efeitos nocivos no organismo humano. Anteriormente, estas avaliações eram realizadas recorrendo à experimentação animal, no entanto com o passar dos anos desenvolveu-se uma consciencialização relativamente ao uso de animais para este fim, o que levou a que restrições legais fossem criadas (em diversos países de todo o mundo) e por conseguinte a uma utilização muito limitada desta prática. Em substituição deste método começaram a desenvolver-se métodos alternativos que permitissem a reprodutibilidade, quantidade e predictibilidade das avaliações. No que diz respeito aos produtos com aplicação tópica, não só a sua eficácia e toxicidade têm de ser testadas mas também a sua eficiência de penetração. A pele sendo a interface entre o organismo e o seu ambiente externo, constitui uma barreira de proteção contra todas as interferências exteriores e é dividida fundamentalmente em 3 camadas: a hipoderme, a derme e a epiderme, esta última a principal responsável pela função de barreira apresentada por este órgão. A epiderme é a camada mais exterior da pele e é constituída por queratinócitos os quais sofrem um processo continuo de diferenciação originando um tecido estratificado. Para que o produto aplicado topicamente penetre a pele e tenha o efeito desejado, esta camada tem de ser transposta. Hoje em dia já existem diversos modelos in vitro de pele humana para testar estes produtos, alguns contendo apenas a epiderme, outros apenas a derme e outros ainda contendo ambas as camadas (epiderme e derme). Todos estes modelos se assemelham morfologicamente e bioquimicamente à pele in vivo, no entanto ainda não exibem uma adequada propriedade de barreira, evidenciando maiores permeabilidades que a pele nativa. Esta disparidade parece estar relacionada com a camada apical da epiderme - stratum corneum - que integra células mortas e achatadas envoltas numa matriz lipídica, onde se observam variações tanto no perfil lipídico como na sua estruturação. Dado verificar-se uma maior permeabilidade nos tecidos in vitro do que nos tecidos in vivo, sempre que um produto é submetido a avaliações toxicológicas e de eficiência de penetração, extrapolações têm de ser realizadas para fases clínicas o que torna o processo pouco preciso. Surge assim a necessidade de descobrir quais os parâmetros que influenciam a formação da barreira da pele durante a cultura de equivalentes epidérmicos humanos in vitro, de forma a gerar um modelo que mais se assemelhe com a epiderme humana nativa, tanto em termos de morfologia como de propriedade barreira. Assim, este projeto pretendeu produzir equivalentes epidérmicos in vitro sob quatro condições distintas, resultantes da alteração independente de quatro fatores relativamente às condições standard de cultura, de forma a avaliar o efeito dessas alterações nos tecidos produzidos e nas suas propriedades de barreira. Para tal, queratinócitos humanos primários isolados foram cultivados em monocamada, cumprindo as regras básicas de cultura celular, e quando estes se encontraram em 4ª passagem foram semeados em insertos com filtro de policarbonato para reconstrução de epidermes in vitro, as quais foram obtidas ao fim de onze dias de interface ar-liquido. Após obtenção dos tecidos epidérmicos, foram realizadas análises histológicas de forma a avaliar as características morfológicas e ensaios de permeabilidade a três fármacos de diferentes polaridades (cafeína, hidrocortisona e testosterona) em células de difusão de Franz para avaliar as propriedades de barreira. Os resultados das análises histológicas foram avaliados por observação microscópica enquanto que os resultados dos ensaios de permeabilidade foram avaliados por leitura espectrofotométrica, a partir da qual se obteve a quantidade de fármaco permeada pelo tecido ao longo do ensaio, que permitiu calcular o seu fluxo. As quatro alterações testadas, que foram implementadas durante a fase de exposição da cultura à interface ar-líquido, foram: (1) o aumento da disponibilidade de factores de autocrinos e homocrinos; (2) o aumento da disponibilidade de nutrientes via suplementação do meio de cultura com FBS; (3) a diminuição da temperatura de incubação; (4) o aumento da disponibilidade de oxigénio. A alteração relativa aos factores autocrinos e homocrinos resultou da dedução de que as células dispunham de pouco tempo em contacto com os factores de sinalização produzidos por elas. Como tal, primeiramente variou-se o período de renovação dos meios de modo a avaliar qual o período ótimo entre renovações consecutivas e posteriormente cultivou-se tecido epidérmico com um período entre renovações estendido de forma a aumentar a sua exposição aos factores. A alteração relativa à suplementação do meio de cultura com FBS adveio de resultados contraditórios descritos na bibliografia, em que certos estudos descrevem o FBS como sendo benéfico para o desenvolvimento da cultura, enquanto que outros descrevem-no como prejudicial. Como tal, realizou-se uma cultura em que este suplemento foi adicionado, numa concentração de 10%, ao meio de cultura de forma a avaliar os seus efeitos. A alteração da temperatura derivou da constatação de que os queratinócitos que integram a epiderme crescem naturalmente a 32 ̊C, temperatura registada à superfície da pele, contrariamente à maioria das células que crescem à temperatura fisiológica humana (37 ̊C). Como tal, inicialmente avaliou-se o impacto da redução da temperatura, para 32 ̊C, no período de desenvolvimento dos queratinócitos e posteriormente desenvolveu-se uma cultura sob essas mesmas condições de forma a avaliar o efeito da temperatura natural na formação da epiderme. A alteração da disponibilidade de oxigénio surgiu de um resultado proveniente de um estudo realizado anteriormente no laboratório, o qual indiciava que as células estavam sob condições limitantes de oxigénio. Como tal, aumentou-se a superfície de contacto entre o meio e a atmosfera de forma a permitir a solubilização de mais oxigénio no meio que nutre as células. Os resultados obtidos em cada alteração foram comparados com os resultados obtidos em equivalentes epidérmicos humanos produzidos in vitro segundo o protocolo adoptado como standard. Verificou-se que à excepção da cultura suplementada com FBS, todas as alterações geraram tecidos com a propriedade de barreira melhorada, ou seja, com uma permeabilidade mais reduzida. Quando a exposição aos factores autocrinos e homocrinos foi aumentada, assim como quando a temperatura de incubação foi diminuída, foram produzidos tecidos bem diferenciados e com uma espessura média superior à apresentada pelos tecidos epidérmicos cultivados em condições standard. Consequentemente, a permeabilidade destes tecidos à cafeina e à testosterona melhorou significativamente (p 0.05). Quando se aumentou a disponibilidade de oxigénio produziram-se tecidos bem diferenciados, mas com uma espessura média bastante próxima à apresentada pelos tecidos epidérmicos cultivados em condições standard. Consequentemente, a permeabilidade destes tecidos à cafeina e à hidrocortisona não mostraram alterações significativas (p > 0.05), contudo apresentaram melhorias significativas na permeabilidade à testosterona (p 0.05). Estes resultados parecem promissores para o desenvolvimento de um protocolo otimizado, porém outros testes complementares à análise histológica e aos ensaios de permeabilidade deveriam ser realizados para uma melhor compreensão do impacto das alterações nos tecidos produzidos. Assim, este trabalho contribui para a percepção de como estes parâmetros podem ser variados para produzir um equivalente epidérmico humano in vitro mais semelhante à epiderme humana nativa. No entanto, é claro que mais estudos são necessários, pois os valores de permeabilidade ainda estão longe dos observados in vivo.The skin is the interface between the organism and the external environment, and its outermost layer - epidermis - is the major responsible for the barrier function of this organ. As such, epidermis is a crucial obstacle to be overcome by any substance intended to penetrate the skin. Cosmetic and pharmaceutical products for topical administration, prior to their placement in the market, are evaluated as to their safety and efficacy as well as penetration efficiency. Previously these tests were performed using animal experimentation. However due to legal demands, this use was discontinued and replaced by in vitro human skin equivalents. Although the in vitro epidermal models currently produced resemble the morphological and biochemical characteristics of the human epidermis, their barrier function is still reduced when compared to in vivo skin, evidencing higher permeability values which require extrapolation to clinical stages. Thus, it is necessary to discover the parameters that influence the skin barrier formation during epidermal tissue culture, in order to generate an in vitro model that better resembles the in vivo human epidermis. This work aimed to produce human epidermal equivalents under four different conditions in order to evaluate the effect of these alterations on the cultured tissue barrier function. The four studied conditions were: increased availability of cellular growth factors; increased availability of nutrients via FBS supplementation; lowered incubation temperature; increased availability of oxygen. Subsequently their morphology was assessed by histological analysis and their permeability by diffusion studies in Franz diffusion cells using three model drugs with different polarities (caffeine, hydrocortisone and testosterone). Out of the four conditions tested, the ones related to cellular growth factors, temperature and oxygen have shown to produce well stratified and differentiated tissues containing all the expected strata. Additionally, these tissues have evidenced statistically significant improvements in reducing permeability. The same was not true for FBS medium supplementation which produced tissues that were poorly consistent and differentiated without a well-defined stratification. These tissues evidenced statistically significant worsening in reducing permeability. This work provides a preliminary insight into how these parameters can be adjusted to produce an in vitro human epidermal equivalent that better resembles the in vivo human epidermis. Although it is clear that further study is needed as permeability values are still far from those observed in vivo