Síntesis de inhibidores de Atg4B y desarrollo de nuevos métodos de bioconjugación basados en derivados del ácido escuárico

El modelo de negocio de I+D de las compañías farmacéuticas está en crisis desde hace décadas debido a los grandes costes y a la baja productividad. En consecuencia, la identificación de nuevos biomarcadores y el desarrollo de nuevas estrategias para detectar y tratar trastornos patológicos es un campo de investigación emergente. Estos enfoques pueden ayudar a comprender mejor el mecanismo de progresión de la enfermedad, así como la identificación de nuevas dianas para la intervención terapéutica. La presente tesis trata dos temas que abordan diferentes aspectos del proceso de descubrimiento de nuevos fármacos. En primer lugar se ha trabajado en la identificación de compuestos activos frente a una diana conocida de tipo biológico y en segundo lugar se ha estudiado el desarrollo de métodos adecuados para la modificación de este tipo de moléculas consideradas como dianas farmacéuticas. La autofagia es un proceso celular que consiste en la degradación lisosomal de componentes citoplasmáticos desechables o potencialmente dañinos. Este proceso regula la degradación lisosomal y el reciclado de orgánulos obsoletos, de proteínas de una vida media larga, de agregados de proteínas y de patógenos. Se produce en condiciones basales y tiene un papel crucial en el desarrollo celular, la diferenciación, la supervivencia y la homeostasis y su funcionamiento anómalo está relacionado con el envejecimiento y múltiples enfermedades como el cáncer y trastornos neurodegenerativos. En condiciones fisiológicas normales, la autofagia se produce a un nivel basal, mientras que en condiciones de estrés, como pueden ser la falta de nutrientes o la presencia del algún estímulo, la actividad autofágica aumenta. En los últimos años se ha comprobado que niveles elevados o deficientes de autofagia están directamente relacionados con varias enfermedades y la modulación de este mecanismo se ha convertido en una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento del cáncer. Existen diferentes vías de regulación para controlar la autofagia y consecuentemente numerosos puntos potenciales de modulación. Una de las proteínas más exploradas para el bloqueo de la autofagia es Atg4B, cisteína proteasa que tiene un papel fundamental en este mecanismo y prescindir genéticamente de Atg4B inhibe el crecimiento del tumor en células cancerosas. Es por ello que el objetivo general del primer capítulo es la identificación selectiva de inhibidores de autofagia mediante la modulación química de Atg4B y así servir de base para futuras intervenciones farmacológicas. Inicialmente se llevó a cabo un cribado virtual utilizando una quimioteca virtual del National Cancer Institute, se descartaron aquellas estructuras conocidas como altamente reactivas y se solicitaron 250 compuestos para estudiar su actividad utilizando un ensayo de cribado de alto rendimiento basado en la tecnología Alpha Screen puesto a punto en el grupo. Se procedió a la síntesis de los compuestos activos identificados para confirmar su identidad y actividad, y se prepararon análogos con la intención de explorar la relación estructura-actividad y obtener moléculas de mayor potencia y características farmacológicas mejoradas. Una vez sintetizados, se estudió su actividad como inhibidores de Atg4B y la actividad celular de los compuestos más potentes. Así pues los derivados de 7-aminobenzo[cd]indol-2(1H)-ona presentaron actividades prometedoras como inhibidores de Atg4B destacando especialmente el compuesto 31 que inhibe la autofagia celular y sensibiliza a las células cancerosas al oxiplatino. Por otro lado, la modificación química de las proteínas es una herramienta importante en el campo de la biología química para el estudio de procesos biológicos, para la caracterización de la actividad de proteínas y para el tratamiento de enfermedades. Esta técnica de bioconjugación combina características de la química sintética y de la biología molecular. Aunque en los últimos años se han descrito varios métodos de modificación específica de proteínas, existe un gran interés en el desarrollo de nuevas estrategias y métodos complementarios que superen las limitaciones de los existentes. En este contexto, el objetivo principal del segundo capítulo es el desarrollo de un método específico de modificación de proteínas mediante el uso de estructuras derivadas del ácido escuárico. Se sintetizó una pequeña biblioteca de diésteres, mono-escuaramidas y tioésteres del ácido escuárico. Inicialmente se escogió la insulina como proteína modelo puesto que era fácilmente analizable mediante análisis de masas y posteriormente se extendió a proteínas de mayor tamaño como la ubiquitina y la mioglobina. Se emplearon varios procedimientos para el estudio del sitio de modificación como son el empleo de agentes alquilantes, diferentes condiciones de pH, la digestión proteica mediante la endoproteinasa Glu-C, estudios de transaminación y de fragmentación MS/MS, entre otros. Todo ello conllevó al desarrollo de un nuevo método aplicable a proteínas en su estado nativo para la modificación del grupo amino situado en el extremo N-terminal a través del alquil tioescuarato 60 presentando menos reactividad pero más selectividad frente a los diésteres de ácido escuárico previamente explorados.The efficiency of R&D models of the pharmaceutical companies declined since decades. Consequently, the identification of new biomarkers and the development of new strategies to detect and treat pathological disorders is an emerging field of research. These approaches may provide a greater understanding of the mechanism of disease progression as well as the identification of novel targets for therapeutic intervention. The following thesis addresses two different subjects in the process of discovering new drugs. In the first place, active compounds have been identified and synthesized in front of a known biological target and in the second place the development of suitable methods for the modification biological targets has been studied. Targeting autophagy is a promising therapeutic strategy for cancer treatment. As a result, the identification of novel autophagy inhibitors is an emerging field of research. We report the development of a novel AlphaScreen HTS assay that combined with a structure-based high- throughput virtual screening have enabled the identification of benzo[cd]indol- 2(1H)-one as a novel scaffold that targets Atg4B. Structural-activity relationship of the initial hit provided an optimized lead compound 31 bearing an 7-aminobenzo[cd]indol-2-[1H]-one scaffold and a propyl group replacing the chlorine. Inhibition of autophagy was also investigated in cells by measuring LC3-II and p62 protein levels. Moreover, the synergistic effect of 31 combined with oxaliplatin resulted in an enhanced cell death in the human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29. We are convinced that the developed AlphaScreen and MS-based assays can be key tools enabling the high-throughput identification of novel Atg4B inhibitors. Moreover, the aminobenzo[cd]indol-2-[1H]-one scaffold represents a novel chemotype for the further development of small molecule inhibitors of Atg4B. Bioconjugation of proteins combines the fields of synthetic chemistry and molecular biology to increase the properties of biomolecules. Proteins and modified peptides are essential tools for the study of biological processes, characterization of protein activity and for the treatment diseases. Several selective methods of proteins have been described in the literature acting on different residues, however the amine in alpha position is attractive for having a specific reaction site for the bioconjugation. A small library of squaric acid derivates was synthesized. In order to study the modification site of the protein, insulin was first used as a model protein because it is easily analyzed by mass analysis (MS), however the presence of a single lysine residue led to the subsequent study with the ubiquitin and myoglobin proteins. Several procedures were applied such as the use of alkylating agents, protein digestion using endoproteinase Glu-C, transaminations studies, fragmentation MS/MS studies, among others. Finally, a new N-terminal modification method based on the alkyl thiosquarate 60 has been developed using sample reactions and mild conditions