Symbiotic bacteria, population genetic structure and insecticide resistance of the whiteflies Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum

The greenhouse or glasshouse whitefly Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleyrodidae) and the cotton whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) are two of the most common and economically important pests of agriculture, affecting a large number of both vegetables and ornamental crops from several families (Solanaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Brassicaceae, Rosaceae, Euphorbiaceae). Τhe importance of B. tabaci as a pest, is being intensified from the fact that this specific insect species is a complex of 42 putative morphocryptic species with different characteristics. The most common and damaging members of the complex are those belonging to Middle East-Asia Minor I, formerly referred to as biotype B (MEAM1) and to Mediterranean, formerly referred to as biotype Q (MED). Currently, the control of whitefly populations relies on chemicals, resulting in high levels of resistance in different classes of insecticides. The majority of insects develop symbiotic relationships with different bacterial species. The latter belong to two categories: a) the primary symbionts which are mainly known to supplement hosts’ diet with important nutrients for their survival and b) the secondary / facultative symbionts which have different functions in their hosts’ biology (metabolism, diet, longevity, self-defense, development rate, insecticide resistance), and they are involved in reproductive abnormalities and cytoplasmic incompatibilities. Symbiotic relationships are close and diverse. Populations of B. tabaci are known to host the obligatory primary symbiont Portiera aleurodidarum and seven secondary symbionts with different patterns of infection: Candidatus Hamiltonella defensa, Arsenophonus spp., Wolbachia spp., Rickettsia spp., Candidatus Cardinium hertigii, Candidatus Fritschea bemisiae and Candidatus Hemipteriphilus asiaticus. Populations of T. vaporariorum apart from the primary symbiont P. aleurodidarum, contain also the secondary symbionts Arsenophonus spp., Candidatus Hamiltonella defensa, Wolbachia spp., Rickettsia spp. and Candidatus Cardinium hertigii. The distribution and density of symbionts depend on a variety of factors regarding both the host species and the type of the bacterial strain. In the frame of the present thesis, the genetic structure and diversity and the phylogenetic relationships between 38 populations of T. vaporariorum collected from a wide geographical range were investigated and characterized, using three mitochondrial (mt) genes (Cytochrome Oxidase I – COI, Cytochrome b – cytb, and NADH dehydrogenase subunit 5 – ND5). The levels of intraspecific variation were very low, since the nine different haplotypes detected were separated into only two maternal lineages. Moreover, the occurrence and distribution of the secondary endosymbionts Wolbachia, Rickettsia, Cardinium, Arsenophonus, Hamiltonella and Fritschea were recorded. The diversity of endosymbionts was very low as well. The symbiont Arsenophonus was completely or almost fixed in all populations and showed the highest prevalence in all of them, whereas the frequencies of the other two symbionts that were detected, Wolbachia and Cardinium, were very low. Arsenophonus genetic diversity was further analyzed using a Multilocus Sequence Typing Analysis (MLST) but between the tested individuals there was not any sign of polymorphism within the bacterial species. It seems that the male-killing effects of Arsenophonus is not the case for T. vaporariorum, since both sexes carry the endosymbiont. The very high prevalence of Arsenophonus in T. vaporariorum is likely to be indicative of a close mutualistic association, and it is possible that the bacterium plays a role in supplementing the host’s nutrition and may complement the role of Portiera in providing nutrition. On the other hand, the coexistence of Portiera and Arsenophonus may indicate a process in which the former is being replaced by the latter, as it has been suggested in previous studies. The near fixation of Arsenophonus in T. vaporariorum, combined with the remarkably low mitochondrial genetic variation, could reflect the effects of a selective sweep, during which a strain of the symbiont could have spread across the host species, carrying along an associated mitochondrial haplotype. The combined symbiont and mitochondrial genetic diversity supports the conclusion that T. vaporariorum is a single species.In the frame of characterizing the composition of the whole bacterial community, the 454 and Illumina amplicon technologies were used in 11 samples of B. tabaci belonging to MED and MEAM1, and two T. vaporariorum samples, all collected from different regions worldwide. The bacterial community seems to be relatively enriched while the separation of the two species based on their bacterial profile is very clear, presenting statistically significant differences. Despite a few variations appearing in the association patterns between the biotypes and the facultative endosymbionts they harbor, our results indicate that the composition of symbionts in whiteflies may depend on the insect species and the biotypes within the same insect species. Gammaproteobacteria is the predominant class in all samples examined, with a range of 63-99%. Portiera and Hamiltonella are within the top hit categories in B. tabaci samples, while Portiera and Arsenophonus in T. vaporariorum samples. The relatively clear association that is observed between the two whitefly species and between the different biotypes of B. tabaci, and the diverse endosymbionts that they carry, suggests ancestral signs of co-evolution. When symbionts spread within a host population, there is a high level of linkage disequilibrium between endosymbiotic community and mitochondrial lineages which may provoke selective sweeps that indirectly influence the polymorphism of mitochondrial DNA and that they may even promote population differentiation or / and species formation. However, the aforementioned correlation – specificity, could be influenced by a variety of factors (geography, host’s diet). This has been already confirmed in previous studies with different insect species.Regarding insecticide resistance, by combining classical bioassays with molecular and functional assays, the resistance status of 35 populations of T. vaporariorum from Greece and other geographical areas against neonicotinoids, pyrethroids and ketoenols (tetronic and tetramic acids), was analyzed. High resistance levels were detected in almost all populations tested. The functional assays undertaken for assessing the possible role of the two cytochrome P450s TvCYP6CM2 and TvCYP6CM3, orthologues of the BtCYP6CM1 known as the major neonicotinoid metabolizer in B. tabaci, showed that the two orthologues do not have important detoxification role in neonicotinoids resistance in T. vaporariorum. In addition, the frequency of the resistance mutation E645K in the acetyl-coenzyme A carboxylase gene (ACC), recently linked to spiromesifen resistance of T. vaporariorum in previous studies, did not have any correlation with spiromesifen toxicity data, suggesting that its role might not be important but additional mechanisms are involved in T. vaporariorum spiromesifen resistance. Moreover, a robust molecular diagnostic test was developed for monitoring the presence and frequency of the pyrethroid-resistance mutations L925I and T929I of the para-type voltage-gated sodium channel gene (VGSC), in order to facilitate the monitoring of resistance and support the management strategies. The use of new pest control practices, which will rely on the integrated management system is a prerequisite, since global whitefly populations have developed resistance in almost all the classes of insecticides. The use of endosymbionts, which have diverse impacts on their insect hosts and cause different reproductive abnormalities, are constantly gaining in popularity as an insect control method. A full study on the symbiotic relationships between bacterial species and insect hosts, but also on the dynamics of the interaction that every symbiont develops with its host, constitutes a very useful tool for hosts’ control and the development of friendly management control practices. Τaking into consideration that some bacterial species may provoke speciation and affect the diverse characteristics of species adaptation, studying and correlating them with the genetic background and the genetic diversity of their hosts (i.e. sporadic patterns and genetic flow) is essential for adopting successful pest management strategies.Ο αλευρώδης των θερμοκηπίων, Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleyrodidae) και ο αλευρώδης του καπνού Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), είναι δύο από τους σημαντικότερους εχθρούς των καλλιεργειών, καθώς επηρεάζουν μεγάλο αριθμό λαχανοκομικών και καλλωπιστικών φυτών διαφόρων οικογενειών. Μάλιστα, η σημαντικότητά του B. tabaci ως εχθρός, ενισχύεται από το ότι το συγκεκριμένο είδος αποτελεί ένα σαφώς καθορισμένο σύμπλοκο με περισσότερα από σαράντα δύο (42), μορφολογικά απαράλλακτα κρυπτικά είδη με διαφορετικές ιδιότητες. Τα πιο διαδεδομένα και καταστροφικά μέλη του συμπλόκου είναι αυτά που ανήκουν στην ομάδα Middle East-Asia Minor Ι προηγουμένως γνωστή ως βιότυπος Β (MEAM1) και στην ομάδα Mediterranean, προηγουμένως γνωστή ως βιότυπος Q (MED). Τα τελευταία χρόνια, ο κύριος τρόπος ελέγχου των πληθυσμών των αλευρωδών είναι η χημική καταπολέμηση, έχοντας ως συνέπεια την ανάπτυξη υψηλών επιπέδων ανθεκτικότητας σε διάφορες ομάδες εντομοκτόνων. Η πλειονότητα των εντόμων αναπτύσσει συμβιωτικές σχέσεις με διάφορα ενδοσυμβιωτικά βακτήρια, τα οποία ανήκουν σε δύο κατηγορίες: α) τα πρωτεύοντα συμβιωτικά που κατά κύριο λόγο παρέχουν στους ξενιστές τους απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την επιβίωσή τους και β) τα δευτερεύοντα συμβιωτικά τα οποία επηρεάζουν ποικίλες παραμέτρους της βιολογίας των ξενιστών τους (μεταβολισμός, διατροφή, μακροβιότητα, αμυντική ικανότητα, ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα), συμπεριλαμβανομένων και των μεταβολών στις αναπαραγωγικές διαδικασίες των ξενιστών τους. Οι συμβιωτικές σχέσεις μεταξύ τους είναι στενές και ποικίλουν. Οι πληθυσμοί του B. tabaci έχει βρεθεί ότι αποικίζονται από το πρωτεύον συμβιωτικό Portiera aleurodidarum και από επτά δευτερεύοντα ενδοσυμβιωτικά με διαφορετικούς συνδυασμούς μόλυνσης: Candidatus Hamiltonella defensa, Arsenophonus spp., Wolbachia spp., Rickettsia spp., Candidatus Cardinium hertigii, Candidatus Fritschea bemisiae και Candidatus Hemipteriphilus asiaticus. Σε πληθυσμούς του T. vaporariorum εμφανίζονται εκτός του πρωτεύοντος ενδοσυμβιωτικού P. aleurodidarum, τα δευτερεύοντα ενδοσυμβιωτικά Arsenophonus spp., Candidatus Hamiltonella defensa, Wolbachia spp., Rickettsia spp. και Candidatus Cardinium hertigii. Η κατανομή και η πυκνότητα των βακτηρίων εντός των ξενιστών τους εξαρτώνται από πλήθος παραγόντων, που αφορούν από τη μία στο είδος του ξενιστή και από την άλλη στον τύπο του βακτηριακού στελέχους. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, προσδιορίστηκε η γενετική δομή και ποικιλομορφία και οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ 38 πληθυσμών του αλευρώδη T. vaporariorum από διάφορες περιοχές της Ελλάδας και του υπόλοιπου κόσμου, χρησιμοποιώντας τρεις μοριακούς μιτοχονδριακούς δείκτες (κυτοχρωμική οξειδάση I - COI, κυτόχρωμα b - cytb, υπομονάδα 5 της NADH αφυδρογονάσης - ND5). Τα επίπεδα ενδοειδικής ποικιλομορφίας είναι ιδιαίτερα χαμηλά, καθώς οι εννιά απλότυποι που προέκυψαν διαχωρίζονται σε δύο μόνο μητρικές γραμμές συγγένειας. Επίσης, έγινε εξέταση των ίδιων πληθυσμών για την παρουσία και την κατανομή των ενδοσυμβιωτικών βακτηρίων Wolbachia, Rickettsia, Cardinium, Arsenophonus, Hamiltonella και Fritschea. Η ποικιλομορφία των ενδοσυμβιωτικών βρέθηκε να είναι επίσης χαμηλή. Το βακτήριο Arsenophonus εμφανίζεται ως το κυρίαρχο, με συχνότητες που αγγίζουν και το 100%, ενώ οι συχνότητες μόλυνσης των άλλων δύο ενδοσυμβιωτικών που εντοπίζονται, Wolbachia και Cardinium, είναι πολύ χαμηλές. Ακολούθησε ανάλυση της γενετικής διαφοροποίησης του επικρατέστερου ενδοσυμβιωτικού Arsenophonus, με τη χρήση του συστήματος MLST (Multi Locus Sequence Typing), αλλά μεταξύ των ατόμων που εξετάστηκαν δεν βρέθηκε γενετική διαφοροποίηση εντός του βακτηριακού είδους. Φαίνεται ότι το φαινόμενο της θανάτωσης των αρσενικών που προκαλεί το βακτήριο Arsenophonus, δεν εμφανίζεται στον T. vaporariorum καθώς και τα δύο φύλα φέρουν το βακτήριο. Η υψηλή κυριαρχία του βακτηρίου Arsenophonus στον T. vaporariorum είναι πιθανό να υποδεικνύει μια στενή σχέση αμοιβαιότητας όπου το συγκεκριμένο βακτήριο πιθανώς να επηρεάζει τον εμπλουτισμό της θρέψης του ξενιστή και να συμπληρώνει το ρόλο του πρωτεύοντος βακτηρίου Portiera στην παροχή θρεπτικών στοιχείων. Από την άλλη, η συνύπαρξη των βακτηρίων Portiera και Arsenophonus μπορεί να υποδεικνύει μια διαδικασία κατά την οποία το πρώτο βακτήριο αντικαθίσταται από το δεύτερο, όπως έχει ήδη προταθεί σε προηγούμενες μελέτες. Το σχεδόν 100% ποσοστό μόλυνσης από το βακτήριο Arsenophonus στον αλευρώδη T. vaporariorum, συνδυαζόμενο με την εντυπωσιακά χαμηλή μιτοχονδριακή γενετική διαφοροποίηση, μπορεί να αντικατοπτρίζει τις συνέπειες μιας επιλεκτικής κίνησης, κατά την οποία ένα στέλεχος από το συμβιωτικό θα μπορούσε να έχει εξαπλωθεί στο έντομο – ξενιστή, μεταφέροντας μαζί του και ένα συσχετιζόμενο μιτοχονδριακό απλότυπο. Η συνδυασμένη συμβιωτική και μιτοχονδριακή ποικιλομορφία ενισχύει το συμπέρασμα ότι ο αλευρώδης T. vaporariorum είναι ένα μοναδικό είδος. Στα πλαίσια της διερεύνησης των βακτηριακών κοινοτήτων χρησιμοποιήθηκε επίσης η Τεχνολογία Βαθιάς Αλληλούχησης (454 και Illumina amplicon sequencing), ώστε να καταγραφεί η ολική σύνθεση της βακτηριακής ποικιλότητας 13 πληθυσμών B. tabaci, των ομάδων MED και MEAM1, και πληθυσμών T. vaporariorum από μία εκτεταμένη γεωγραφική κατανομή. Η βακτηριακή κοινότητα των δύο ειδών αλευρωδών φαίνεται να είναι υψηλά εμπλουτισμένη και ο διαχωρισμός των δύο ειδών βάση του βακτηριακού προφίλ είναι αρκετά ξεκάθαρος, παρουσιάζοντας σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ τους. Παρά τις λίγες διακυμάνσεις στα μοτίβα συσχέτισης μεταξύ των γενετικών ομάδων και των ενδοσυμβιωτικών που φιλοξενούν, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σύσταση των συμβιωτικών βακτηρίων των αλευρωδών εξαρτάται από το είδος του εντόμου αλλά και τις διαφορετικές γενετικές ομάδες μέσα στο ίδιο είδος. Τα Gammaproteobacteria είναι η κυρίαρχη ομάδα σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν, με εύρος 63-99%. Τα βακτήρια Portiera και Hamiltonella είναι εκείνα που κυριαρχούν στα δείγματα του B. tabaci, ενώ τα βακτήρια Portiera και Arsenophonus στα δείγματα του T. vaporariorum. Η σχετικά ξεκάθαρη σχέση που προκύπτει μεταξύ των βακτηρίων που εντοπίστηκαν και των διαφορετικών γενετικών ομάδων του B. tabaci αλλά και των διαφορετικών ειδών αλευρωδών, δηλώνει αρχέγονα σημάδια συνεξέλιξης μεταξύ τους. Η διαταραχή της ισορροπίας σύνδεσης μεταξύ των ενδοσυμβιωτικών κοινοτήτων και των μιτοχονδριακών τύπων που προκαλείται από τη διασπορά των συμβιωτικών στον πληθυσμό ενός ξενιστή, είναι πιθανόν να προκαλέσει επιλεκτικές κινήσεις οι οποίες επηρεάζουν την ποικιλότητα του μιτοχονδριακού DNA και οι οποίες μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα ακόμη και την ειδογένεση. Βέβαια, η παραπάνω συσχέτιση - ειδικότητα μπορεί να επηρεάζεται από διάφορες οικολογικές παραμέτρους (π.χ γεωγραφία, δίαιτα του ξενιστή), γεγονός που έχει επιβεβαιωθεί σε προηγούμενες μελέτες με άλλα είδη εντόμων. Αναφορικά με την ανθεκτικότητα, διερευνήθηκαν τα επίπεδα και οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας 35 πληθυσμών T. vaporariorum από την Ελλάδα και άλλες γεωγραφικές περιοχές του κόσμου, στα νεονικοτινοειδή, στα πυρεθροειδή και στις κετοενόλες (τετρονικά και τετραμικά οξέα), συνδυάζοντας κλασικές βιοδοκιμές με μοριακές και λειτουργικές αναλύσεις. Υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας παρατηρούνται σχεδόν σε όλους τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν. Οι λειτουργικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του πιθανού ρόλου των ομολόγων της BtCYP6CM1, γνωστής για το ρόλο της στο μεταβολισμό των νεονικοτινοειδών στον αλευρώδη B. tabaci, TvCYP6CM2 και TvCYP6CM3, έδειξαν ότι οι εν λόγω οξειδάσες δεν φαίνεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο αποτοξικοποίησης των νεονικοτινοειδών στον αλευρώδη T. vaporariorum. Επιπροσθέτως, η συχνότητα και διασπορά της μεταλλαγής ανθεκτικότητας Ε645Κ στο γονίδιο της καρβοξυλεστεράσης του ακέτυλο-συνενζύμου Α (ACCase), που έχει συνδεθεί με την ανθεκτικότητα στο spiromesifen σε άλλες εργασίες, δεν παρουσιάζει συσχέτιση με τα τοξικολογικά δεδομένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ρόλος της μπορεί να μην είναι σημαντικός, αλλά στην ανθεκτικότητα του T. vaporariorum στο spiromesifen να εμπλέκονται άλλοι μηχανισμοί.Τέλος, αναπτύχθηκε ένα διαγνωστικό τεστ για την παρακολούθηση της παρουσίας και της συχνότητας των μεταλλαγών L925I και T929I στο γονίδιο καναλιού μεταφοράς ιόντων νατρίου (VGSC) στις οποίες οφείλεται η ανθεκτικότητα στα πυρεθροειδή, ώστε να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της ανθεκτικότητας και την υποστήριξη προγραμμάτων φυτοπροστασίας.Η ανθεκτικότητα που έχουν αναπτύξει οι πληθυσμοί των αλευρωδών παγκοσμίως σχεδόν σε όλες τις ομάδες εντομοκτόνων, χρήζει επιτακτική την ανάγκη εύρεσης νέων στρατηγικών καταπολέμησης, που θα βασίζονται στην ολοκληρωμένη αντιμετώπιση. Η χρήση των ενδοσυμβιωτικών βακτηρίων, που επιδρούν με τους ξενιστές τους και προκαλούν αναπαραγωγικές ανωμαλίες, ως μέσο καταπολέμησης των εντόμων, κερδίζει όλο και περισσότερο έδαφος. Η πληρέστερη μελέτη των συμβιωτικών σχέσεων μεταξύ βακτηρίων και εντόμων – εχθρών των καλλιεργειών, και ο σχηματισμός μιας ολοκληρωμένης εικόνας σχετικά με τις σχέσεις και το δυναμικό των αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει το κάθε βακτήριο με τον ξενιστή του, αποτελεί ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τον έλεγχό των ξενιστών και για την ανάπτυξη φιλικών μεθόδων καταπολέμησης. Ιδιαίτερα δε, λαμβάνοντας υπόψιν ότι κάποια βακτήρια αποτελούν παράγοντες ειδογένεσης και επιδρούν στα διάφορα χαρακτηριστικά προσαρμοστικότητας των ειδών, η μελέτη τους και η συσχέτισή τους με το γενετικό υπόβαθρο και τη γενετική ποικιλομορφία των ξενιστών τους, και ειδικότερα σε θέματα που αφορούν στα μοτίβα διασποράς και στη γονιδιακή ροή, αποτελεί σημαντικό βήμα για την υιοθέτηση αποτελεσματικών στρατηγικών καταπολέμησης