Whole exome sequencing to uncover the genetic etiology of a cohort of patients with suspected mitochondrial leukoencephalopathies

The number of identified Mendelian disorders has far surpassed what would be possible without advancements in DNA sequencing technologies, such as whole exome sequencing (WES). In medicine, this advancement has become an invaluable tool for rapidly identifying the underlying molecular causes of rare diseases and is essential in diagnosis, treatment, and further genetic counselling. In the case of leukodystrophies, a group of rare heritable white matter diseases that primarily present in children with distinct Magnetic Resonance Imaging (MRI) patterns, there are still many unsolved genetic cases. The first section of this project focuses on identifying the etiology of a cohort of patients with unsolved mitochondrial leukoencephalopathies, a non-hypomyelinating leukodystrophy caused by disruption of mitochondrial function. WES analysis was performed on 11 patients using custom gene panels and variant categorization calling using guidelines from the American College of Medical Genetics (ACMG). From this analysis, a large mitochondrial DNA deletion was identified in one patient, while biallelic variants in MBOAT7, WDR62, PDHA1, and AARS were identified in four other patients. We identified a strong gene candidate in 5/11 patients, i.e. 45% of the patients, a rate that is similar to what has been published in other cohorts. The second portion of this project focuses on investigating the functional consequences of two novel variants identified in the aminoacyl-tRNA synthetase for alanine (AARS) in one of our patients. The patient presented a novel phenotype of AARS-related disorder and the patient-specific variants, (NM_001605.2) c.295G>A; p.E99K & c.778A>G; p.T260A, were proven to be pathogenic. The patient’s AARS variants were confirmed to be in trans, with the c.295G>A being inherited from the mother and c.778A>G being identified as a de novo variant by cDNA amplification and cloning techniques. The functional consequences of these variants on messenger RNA was assessed next, in addition to protein and cellular localization of AARS. A significant increase was seen in mRNA levels, however, the AARS proteins levels were significantly reduced. Finally, AARS typically has a homogenous distribution in the cytoplasm, yet patient’s fibroblasts showed an altered distribution with abnormal puncta staining. Assessment of AARS aminoacylation activity in patient-derived fibroblasts, completed by collaborators, revealed a reduction of AARS activity at 16% compared to that of a control. Taken together, these functional tests demonstrate the variants have caused functional defects in AARS protein and that this patient presents with a novel AARS phenotype. By identifying strong candidates in patients with unsolved suspected mitochondrial leukoencephalopathies, WES continues to be demonstrated as an invaluable tool in the identification of the molecular causes for rare diseases. Investigations into patient-specific AARS variants provide evidence for the phenotypic expansion of AARS-related diseases and the specific functional defects that underlie these late-onset cases. As the pathophysiological understanding of aminoacyl t-RNA synthetases is still limited, our work as well as others’ will be invaluable to our foundational understanding of this group of disorders, opening the door to the development of potential therapies.Le nombre de maladies mendéliennes identifiées à ce jour a largement dépassé ce qu’il aurait été possible sans le progrès des technologies de séquençage de l'ADN tel que le séquençage d'exome entier (WES). En médecine, cette avancée est devenue un outil indispensable à l’identification rapide des causes moléculaires des maladies rares, en plus d’être essentielle pour le diagnostic, le traitement et les conseils génétiques associés à ces maladies. Dans le cas des leucodystrophies, un groupe de maladies héréditaires rares affectant la substance blanche, touchant principalement les enfants et présentant un profil spécifique d'imagerie par résonance magnétique (IRM), il existe encore de nombreux cas génétiques non résolus.La première partie de ce projet porte sur l'identification de l'étiologie d'une cohorte de patients atteints de leucoencéphalopathies mitochondriales non résolues. Ces dernières sont des leucodystrophies non hypomyélinisantes causées par une perturbation de la fonction mitochondriale. L’analyse WES a été effectuée sur 11 patients à l'aide de panels de gènes prédéfinis et suivant les lignes directrices de l'American College of Medical Genetics (ACMG). De ces analyses, une délétion importante de l'ADN mitochondrial a été identifiée chez un patient et des variants bialléliques dans les gènes MBOAT7, WDR62, PDHA1 et AARS ont été identifiés chez quatre autres patients. Nous avons identifié un gène candidat chez 5 des 11 patients, ce qui équivaut à 45% de la cohorte. Ce taux est similaire à celui publié dans les autres cohortes.La deuxième partie de ce projet porte sur l’étude fonctionnelle de deux nouveaux variants identifiés dans l’aminoacyl-ARNt synthétase de l’alanine (AARS) chez l’un de nos patients. Le patient présente un nouveau phénotype associé à un trouble lié au gène AARS et les variants identifiés (NM_001605.2) c.295G> A; p.E99K & c.778A> G; p.T260A se sont révélés pathogéniques. Il a été confirmé que les variants de AARS du patient étaient en trans, que la mutation c.295G>A a été héritée de la mère et par les techniques d’amplification et de clonage d’ADN complémentaire que la mutation c788A> G est de novo. Les conséquences fonctionnelles de ces variants sur l'ARN messager ainsi que sur la localisation protéique et cellulaire de AARS ont ensuite été évaluées. Une augmentation significative des niveaux d’ARNm a été constatée. Cependant, les taux de protéines AARS ont été réduits de manière significative. De plus, la protéine AARS est distribuée de façon homogène dans le cytoplasme, mais dans les fibroblastes du patient, la distribution de la protéine AARS est perturbée et est sous forme anormale en puncta. L’évaluation de l’activité d’aminoacylation de AARS dans les fibroblastes dérivés du patient, réalisée par des collaborateurs, a révélé une réduction de l’activité de l’AARS de 16% par rapport à celle d’un témoin. Pris ensemble, ces tests fonctionnels montrent que les variants ont provoqué des défauts fonctionnels dans la protéine AARS et que ces défauts causent le nouveau phénotype associé à AARS chez notre patient.En identifiant des gènes candidats chez les patients atteints de leucoencéphalopathies mitochondriales non résolues, le WES s’avère être un outil précieux pour l’identification des causes moléculaires des maladies rares. L’étude des mutations de AARS, spécifiques à certains patients, permet d’apprécier l’expansion phénotypique des maladies reliées à AARS ainsi que les défauts fonctionnels spécifiques qui sont associés avec les cas d’apparition tardive. Puisque la compréhension pathophysiologique des aminoacyl ARNt synthétases est limitée à ce jour, notre travail ainsi que celui d’autres chercheurs est indispensable à une meilleure compréhension de ce groupe de maladies, ouvrant ainsi la porte au développement de thérapies potentielles