Efficacy, safety, and delivery of anti-HIV short-hairpin RNA molecules for use in HIV gene therapy

Although combination antiretroviral therapy can prevent the progression of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) infection to acquired immunodeficiency syndrome, it cannot cure the infection, due in part to the persistence of latent viral reservoirs. Alternatively, gene therapy could be used to develop an HIV cure: a patient’s hematopoietic stem cells (HSCs) could be modified ex vivo to express molecules that inhibit HIV replication and transferred back to the patient where they could serve as a source of HIV-resistant immune cells. Many molecules have been developed to inhibit HIV replication, and one major class are the short hairpin (sh)RNAs which can direct the host RNA interference machinery against HIV RNAs. Although many anti-HIV shRNAs have been developed and some have been used in gene therapy clinical trials, little is known on the comparative efficacy and toxicity of molecules designed by different groups. Also, while HIV-based lentiviral vectors (LVs) are the leading gene delivery tool in HIV gene therapy, clinical trials have been hampered by low HSC transduction, in part because anti-HIV molecules can inhibit their production.Our first hypothesis was that the delivery of anti-HIV shRNAs can be enhanced by optimizing LV production. Our second hypothesis was that we can identify optimal anti-HIV shRNA candidates for gene therapy by comparing the efficacy, toxicity, and target site conservation of both novel and previously-designed shRNAs.Our first aim was to enhance the LV-mediated delivery of anti-HIV shRNAs. We identified a combination of HIV-based LV production plasmids that generated higher titers of LVs compared to a combination recently used in a gene therapy clinical trial. The production of these LVs was inhibited by anti-HIV shRNAs targeting the gag or tat/rev genes, but this inhibition was overcome by increasing the concentration of the packaging plasmid during LV production, as this plasmid encodes the components targeted by our molecules. As an alternative strategy to overcome the inhibition of LV production by anti-HIV shRNAs, we developed a hybrid feline (F)IV:HIV LV delivery system and showed that production of these LVs was not inhibited by our anti-HIV shRNAs. However, these hybrid LVs had low transduction efficiencies in a T lymphocytic cell lines and further troubleshooting is necessary before they can be considered a viable option for gene therapy. Finally, we designed a system to evaluate the ability of gag-pol genes from different HIV strains to generate LVs, and we identified a gag-pol gene which enhances LV production compared to that of our leading packaging plasmid. Our second aim was to identify safe and potent anti-HIV shRNAs. We assessed the target site conservation of shRNAs identified by other groups, as well as that of an shRNA targeting the gag gene previously identified by our lab and an shRNA targeting the tat/rev sequence used in combination with other molecules in a gene therapy clinical trial (sh5983). We then assessed the potency of top candidates to inhibit HIV-1 production and selected the most potent molecules for further characterization in a human T lymphocytic cell line (SUP-T1). From this screen, we identified 5 highly potent shRNAs, 3 of which delayed HIV infection in SUP-T1 cells for a longer time than did sh5983. Two of these shRNAs had no noticeable cytotoxic effects and did not activate the interferon pathway in SUP-T1 cells. We have developed two methods to overcome the inhibition of LV production by anti-HIV shRNAs, and we have identified an optimal gag-pol gene sequence which increases LV production. These findings could potentially be applied in a therapeutic context to enhance the transduction of patients’ HSCs. Additionally, we have identified highly potent shRNAs which are non-cytotoxic in vitro and target highly-conserved sites in the HIV genome. As such, these shRNAs are optimal candidates for use in combination gene therapy against HIV infections. Les traitements antirétroviraux contrôlent la réplication du virus de l’immunodéficience humaine type 1 (VIH) et la progression de l’infection mais ne peuvent pas guérir l’infection. La thérapie génique est une alternative prometteuse: des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de patient.e.s pourraient être isolées, modifiées pour exprimer des molécules qui empêchent la réplication du VIH, et réintroduites dans les patient.e.s, où elle formeraient un réservoir de cellules immunitaires résistantes au VIH. Plusieurs molécules qui empêchent la réplication du VIH ont été développées. Entre autres, les petits ARN en épingle à cheveux (pARNec) constituent une catégorie importante et utilisent le mécanisme cellulaire d’interférence par l’ARN pour couper les ARN viraux. Plusieurs pARNec anti-VIH ont été développés et certains entrent dans des essais cliniques de thérapie génique. Cependant, la comparaison de l’efficacité et de la toxicité de ces molécules demeure peu étudiée. De plus, ces molécules sont exprimées à l’aide de vecteurs lentiviraux (VL), mais ces VL n’atteignent que de faibles taux de transduction dans les essais cliniques, en partie parce que les molécules anti-VIH inhibent leur production. Notre première hypothèse était que l’expression de pARNec anti-VIH pouvait être augmentée en optimisant la production de VL. Notre deuxième hypothèse était que nous pouvions identifier des pARNec anti-VIH optimaux pour utiliser dans le contexte de la thérapie génique en comparant l’efficacité, la toxicité, et la conservation de la séquence ciblée de nouvelles molécules et de molécules qui ont déjà été développées.Notre premier objectif était d’améliorer l’expression de pARNec en optimisant les systèmes de VL. Nous avons identifié une combinaison de plasmides qui produit plus de VL qu’une combinaison utilisée récemment dans un essai clinique de thérapie génique. La production de ces VL est inhibée par deux pARNec visant les gènes gag et tat/rev, mais nous avons surmonté cette inhibition en augmentant la concentration du plasmide qui code pour gag et tat/rev. Nous avons également démontré que la production de VL hybrides à base du virus de l’immunodéficience féline (VIF) et du VIH n’était pas inhibée par nos pARNec. Cependant, ces VL ne pouvaient pas transduire efficacement une lignée de lymphocytes T humaine et ce système doit être amélioré. Finalement, nous avons comparé la production de VL à base de gènes gag-pol provenant de différentes souches de VIH et nous avons identifié un gène gag-pol qui génère plus de VL que le gène utilisé dans notre meilleur plasmide d’emballage. Notre deuxième objectif était d’identifier des pARNec qui sont sécuritaires et efficaces. Nous avons comparé la conservation des séquences ciblées par des pARNec développés par différents groupes, ainsi que par un pARNec qui cible gag et un qui vise tat/rev (sh5983) inclus dans un essai clinique de thérapie génique. Nous avons également développé de nouveaux pARNec. Nous avons ensuite mesuré l’impact des meilleurs pARNec sur la production du VIH et nous avons comparé l’efficacité et la toxicité de nos meilleurs pARNec dans une lignée de lymphocytes T humaine. Nous avons identifié 5 pARNec qui inhibent fortement la réplication du VIH, dont 3 plus actifs que sh5983. De plus, nous n’avons détecté aucune activité cytotoxique ou activatrice des voies de l’interféron associées à l’expression de deux de ces molécules. Nous avons développé deux méthodes pour surmonter l’effet inhibiteur des pARNec anti-VIH sur la production de VL, et nous avons identifié un gène gag-pol qui augmente la production de VL. Ces résultats pourraient être appliqués dans un contexte clinique pour augmenter la transduction des CSH de patient.e.s. De plus, nous avons identifié des pARNec très actifs contre le VIH qui semblent non-cytotoxiques et qui visent des régions conservées dans le génome du virus. Ces molécules sont des candidats de choix pour la thérapie génique contre le VIH