Development of Proliposomal and Liposomal Formulations with Poorly Water-soluble Drugs

Liposomes have been of great pharmaceutical interest for many years due to their potential as colloidal systems that are used for incorporation of hydrophilic active substances into the aqueous core as well as intermediate layers. However, hydrophobic compounds can be embedded between the lipid layers that have a protective function against enzymatic degradation in the body. The main disadvantage of such vehicles is their limitation regarding shelf life and large-scale production of liposomal dispersions. To overcome these drawbacks, the development of proliposomes (PLs) is one possible approach because they are are characterized by their solid state as dry, free-flowing granular products, which form multilamellar vesicles (MLVs) after the addition of water or after having contact with biological fluids in vivo. Furthermore, they can show good oral bioavailability, prolonged shelf life time and easier handling of scale up. Overall, this thesis deals with the development of proliposomal formulations and corresponding liposomes which are formed in situ with subsequent analysis regarding size, zeta potential (ZP) and encapsulation efficiency (EE) for two poorly water-soluble water drugs. Hereby, the development of manufacturing methods for PLs was focused on an in depth analysis and characterization of in situ formed liposomes. Initially, a coating process for small batch sizes was created and afterwards transferred to larger scale production using a Glatt® Coater. In addition, the production of PLs by spray drying was also investigated. The aim of the project was the formation of PLs with established coating or spray drying processes that resulted in good reconstitutability and EE. Furthermore, PLs were suitable precursors for direct compression producing tablets. Fenofibrate and ibuprofen were selected as model drugs representing poorly water-soluble compounds according to Biopharmaceutics Classification System (BCS) class II. First, liposomes were produced using the conventional round bottom flask method as a reference for the manufacture of liposomes. By varying the treatment procedure (filtration, addition of ultrasonic sound or vortexing) of the liposomal dispersion after reconstitution, the limits of the method regarding on vesicles’ size, polydispersity index (PDI) were investigated as well. The observation time was set to 48 h. It was shown that the mean liposome size of the placebo batch was ~ 320 nm. A slight decrease in nanoparticular size was observed after 48 h (~ 300 nm). The smallest vesicles were achieved by the combination of all three treatment methods (filtration, ultrasonic sound and vortexing). The smallest effect on the vesicle size was shown for the batch treated by vortexing. However, even smaller vesicles (~ 250 nm) were formed with encapsulation of the active pharmaceutical ingredient (API) ibuprofen. Here, the liposomal size as well as the PDI were both stable during the investigation period. All batches showed smaller vesicles than the untreated reference dispersion. The ZP exhibited a tendency towards negative values over 48 h for both batches irrespective of drug loading. Highest ZP values were achieved after ultrasonic sound application, both, for placebo as well as API batches. Furthermore, the stability of liposomal dispersions was investigated for 48 h by varying the pH-value. A shift to more basic conditions with pH-levels of ~ 11 had the highest impact factor on a uniform liposomal size. Moreover, also the ZP was stabilized in the range of - 30 mV by increasing the pH-level. The reconstitution medium (water or 10% (w/V) lactose solution) did not have any influence on the liposomal size or ZP. In the second part, a lab scale coating method was developed as a tool for small scale investigations on various parameters affecting the manufacture of PLs and liposomes formed thereof. After defining promising process parameters, the process was successfully transferred to a larger scale using a Glatt® Coater and a promising formulation was prepared. Using scanning electron microscopy (SEM) and macroscopic investigations, the surface of different carrier materials (water-soluble and water-insoluble) was examined. The applied layers were clearly recognizable and the various lipid types could be differentiated. With polarization microcopy and cryo-/transmission electron microscopy (TEM), the formation, presence and differentiation of liposomes and PLs after reconstitution were successfully investigated. Spherical vesicles were visible by absorption of complementary polarized light with Maltese crosses as a typical characteristic feature. The images showed unilamellar vesicles (ULVs) after extrusion, whose size also corresponded to the dynamic light scattering (DLS) measurements. Furthermore, a comparison of the two different preparation methods (conventional round bottom flask on the one hand and liposomes formed out of PLs after addition of aqueous phase on the other hand) was performed. Different kind of carriers (water-soluble, water-insoluble) were examined. No significant differences in size of raw liposomal dispersions were measured. After extrusion through a 0.4 µm polycarbonate membrane, smaller carriers resulted in the formation of smaller liposomes. In summary, the developed manufacturing methods of PLs showed no disadvantages in comparison to the conventional method. Furthermore, the classical round bottom flask method was modified and varied with an adaption to the production of PLs. A storage stability study was performed for six months choosing a temperature of 40 °C in a drying cabinet. The prevailing conditions revealed no negative influence on liposomal size or size distribution for proliposomal formulations consisting of water-soluble carriers. The stability of the liposomal dispersion was improved regarding ZP. Xylitol and sucrose seemed to be the most stable formulations with respect to a uniform liposomal size. In addition, the PDI of the two formulations was stable during six months with a narrow size distribution. ZP increased up to ~ - 20 mV. During proliposomal formulation development, changes in powder carrier materials and lipid-to-carrier ratio were performed. The latter variation seems to be a promising approach with focus on the preparation of smaller vesicles. In addition to giving proof of the existence of PLs using polarization microscopy, the total number of vesicles per mm3 for different types of lipids was determined using a Thoma counting chamber. With higher total numbers, liposomal size decreased. 1,2-Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (18:0; DSPC) and egg-phosphatidylcholine (egg-PC) were identified as promising lipids for a design of experiments (DoE) approach. Based on these results, a larger-scale production of PLs was established with the Glatt® Coater. The combination of the lipids egg-PC, 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (14:0; DMPG) and cholesterol was chosen as most suitable formulation regarding the favored properties of size, ZP and EE. With respect to the phase transition temperature of the lipid components that is below 37 °C, this condition was chosen as release temperature for HPLC experiments. Furthermore, a proliposomal granulate using Tablettose® as carrier and fenofibrate or ibuprofen as API was produced, which enabled a successful further compression to tablets as solid dosage form. Even after reconstitution of the tablets, liposomes were formed spontaneously. An EE of almost 100 % was determined for the poorly soluble drug fenofibrate. Due to its lipophilicity, the API might integrate in the membrane and increase the vesicle size. Moreover, release studies with the same active ingredient were carried out in order to determine the released drug amount. Proliposomal formulations based on the sucrose carrier (2,500 - 3,300 µm; GHP 5) showed an initial burst release within three hours. There was no tendency for a “grease ball” formation of fenofibrate and consequently the whole API amount was homogenously solubilized in the vesicles. In the last part, a manufacturing method for PLs via spray drying was developed. First, a suitable carrier material had to be produced, which should have a narrow particle size distribution to guarantee no choking of the nozzle. The lipids formed a layer around the suspended carrier particles. The influence of the inlet air temperature (Tinlet) and flow rate was investigated with a temperature of 110 °C and a flow rate of 3 ml*min-1. The average yield was at 75 %, with d50-value of ~ 4 µm. In addition to three microparticulated mannitol samples for the production of PLs, one sample was also prepared by spray freeze drying with a d50-value of ~ 12.5 µm. Four batches of spray dried PLs were investigated. After reconstitution with water, liposomes were formed spontaneously, and their presence was approved by polarization microscopy. However, it should be mentioned that the total number of liposomes per mm3 was two times the number of liposomes formed via coating method. The vesicle size (d50-value between 3 and 7 µm) was dependent on the size of microparticulated mannitol and not on the size of PLs. 10 % (w/V) of spray dried mannitol provided the most preferred result with narrow size distribution, a slightly negative potential and a homogenous reconstitutability. Furthermore, the porous character of spray-freeze dried mannitol led to small vesicles. Finally, both manufacturing methods were directly compared regarding their characterization and approaches for possible future directions were shown. With respect to the development of different proliposomal formulations with poorly water-soluble drugs, two production methods were successfully established by spray drying and coating. All formulations were storage-stable and formed spontaneously liposomes after reconstitution in aqueous medium. These vesicles have been investigated i.a. by cryo-TEM and revealed homogenously distributed, round shaped ULVs. Furthermore, the liposomes have been characterized with respect to size, EE, ZP and release behaviour. By means of a DoE, the coating method was successfully transferred from the laboratory to a larger production scale. In addition, proliposomal granules were pressed into tablets, which represents a promising approach for increasing the bioavailability of sparingly soluble substances.Liposomen sind seit vielen Jahren von großem pharmazeutischem Interesse. Es ist möglich hydrophile Wirkstoffe in den wässrigen Kern sowie in wässrige Zwischenschichten von Liposomen einzulagern. Hydrophobe Wirkstoffe werden jedoch in der Lipid-Doppelmembran eingebaut, die eine Art Schutzfunktion auf die eingeschlossenen Wirkstoffe ausübt und den enzymatischen Abbau im Körper behindert. Ein Nachteil liposomaler Dispersionen ist ihre begrenzte Haltbarkeit, sowie die begrenzte Herstellung im größeren Maßstab. Eine Abhilfe gegenüber genannten Einschränkungen, stellt die Entwicklung von Proliposomen (PL) dar, die sich durch ihre feste Ausgangsform auszeichnen. Sie sind definiert als granulatartige, frei-fließende Produkte, die in situ multilamellare Vesikel (MLVs) nach der Zugabe von Wasser oder biologischen Flüssigkeiten bilden. Weiterhin weißen sie eine gute orale Bioverfügbarkeit, verlängerte Haltbarkeit und leichtere Herstellungsmöglichkeiten im größeren Maßstab auf. Im Fokus dieser Arbeit stand die Entwicklung verschiedener proliposomaler Formulierungen sowie die anschließende Charakterisierung der sich in situ bildenden Liposomen hinsichtlich liposomaler Größe, Zetapotential (ZP) und Einschlusseffizienz (EE) zweier schwer wasserlöslicher Wirkstoffe analysiert wurden. Hierbei stand die Entwicklung von proliposomalen Herstellungsmethoden und der sich daraus bildenden Liposomen im Fokus. Zunächst wurde ein Coating-Verfahren im Kleinmaßstab entwickelt, das im Anschluss auf einen Glatt® Coater im größeren Labormaßstab transferiert wurde. Daneben fand auch die Herstellung von Liposomenzubereitungen mittels Sprühtrocknung Anwendung. Ziel der Arbeit war es, PL mit den beiden etablierten Verfahren zu produzieren, die eine gute Rekonstituierbarkeit und EE aufweisen und unter anderem auch zur direkten Tablettierung mit einer Exzenterpresse geeignet sein sollten. Als Modellarzneistoffe für schwer wasserlösliche Substanzen nach dem Biopharmazeutischen Klassifizierungssystem (BCS) Klasse II, fiel die Wahl auf den Lipidsenker Fenofibrat sowie das Analgetikum Ibuprofen. Zunächst wurden Liposomen mittels konventioneller Rundkolbenmethode, welche als Referenz fungieren sollte, hergestellt. Dabei sollte die liposomale Größe, der Polydispersitätsindex (PDI) sowie das ZP nach unterschiedlicher Vorbehandlung (Filtration, Zugabe von Ultraschall oder Vortexen) der liposomalen Dispersion untersucht werden, um die Grenzen des Verfahrens auszutesten. Das Ganze wurde über einen Zeitraum von 48 h ab Zeitpunkt der Herstellung beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die mittlere Liposomengröße in der Placebo-Charge bei einem Wert von ~ 320 nm lag, die über nach zwei Tagen auf ~ 300 nm gesunken ist. Die kleinsten Vesikel wurden durch die Kombination aller drei Behandlungsmethoden, Vortexen, Ultraschall sowie Filtration, erreicht. Geringsten Einfluss hatte lediglich vorheriges Vortexen. Bei den Chargen, die den verkapselten Wirkstoff Ibuprofen enthielten, bildeten sich kleinere Vesikel (~ 250 nm). Die Größe sowie der PDI waren in diesem Fall über zwei Tage stabil. Hierbei konnte kein eindeutiger Trend durch eine Nachbehandlung der liposomalen Dispersion erkannt werden. Bei der Placebo-Charge war jedoch ein leichter Abfall in der Größenmessung zu erkennen. Das ZP veränderte sich bei beiden Versuchsästen über einen Zeitraum von 48 h hin zu negativeren Werten. Der höchste Betrag des Zetapotentials wurde nach dem Zusatz von Ultraschall sowohl bei Placebo- als auch bei Wirkstoff-Chargen erreicht. Desweiteren wurde die Stabilität von Liposomendispersionen über 48 h durch Variation des pH-Wertes untersucht. Es hat sich gezeigt, dass eine Verschiebung zu basischerem pH-Wert (~ 11) den größten Effekt auf eine einheitliche Liposomengröße hat. Dies spiegelte sich auch in einem stabilisierenden ZP mit einem Wert von - 30 mV wieder. Die verschiedenen Rekonstitutionsmedien (Wasser oder 10%-iger (m/V) Lactoselösung) hatten keinen Einfluss auf die Liposomengröße und das Zetapotential. Im zweiten Teil der Arbeit gelang es eine Coating-Methode im Labormaßstab zu entwickeln, die im Anschluss nach der Definition versprechenden Prozessparameter erfolgreich mit einer vielversprechenden Formulierung auf den Produktionsmaßstab im Glatt® Coater transferiert wurde. Mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) und makroskopischen Analysen wurden die Oberflächen der verschiedenen Trägermaterialien vor und nach dem Coating untersucht. Die aufgetragenen Schichten waren deutlich erkennbar. Ebenso konnten die unterschiedlichen Lipidarten differenziert werden. Der Beweis für die Bildung und Anwesenheit von aus Proliposomen gebildeten Liposomen wurde mit Hilfe von Polarisationsmikroskopie und (Cryo-) Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erfolgreich erbracht. Durch die Absorption von komplementär polarisiertem Licht durch den Polfilter wurden sphärische Vesikel mit Malteserkreuzen, als typisch charakteristisches Merkmal, sichtbar. Die TEM-Aufnahmen gaben ebenfalls Hinweise auf die Bildung von Liposomen. Deutlicher Beweis, dass es sich nach Rekonstitution um Liposomen handelte, stellte die Cryo-TEM dar. Die Aufnahmen zeigten nach Extrusion eindeutige unilamellare Vesikel (ULVs), deren Größe auch mit den dynamischen Lichtstreuungs-Messungen (DLS) übereinstimmten. Ebenfalls wurde die Charakterisierung von Liposomen basierend auf der konventionellen Rundkolbenmethode und der Rekonstitution von Proliposomen verglichen. Unterschiedliche Arten von Trägern (wasserlöslich, wasserunlöslich) kamen zum Einsatz. Die unbehandelte Liposomendispersion wies keinen wesentlichen Unterschied hinsichtlich der Größe der Vesikel auf. Nach Extrusion durch die 0,4 µm Membran zeigte sich, dass sich bei kleinerer Trägergröße auch kleinere Liposomen bildeten. Es stellte sich heraus, dass die entwickelte Herstellungsmethode gegenüber der konventionellen keine Nachteile mit sich brachte. Zusätzlich wurde die klassische Rundkolbenmethode modifiziert und verändert, um diese mehr an den Prozess der PL-Herstellung anzugleichen. Eine Stabilitätsstudie zur Lagerung von Proliposomen wurde für sechs Monate bei 40 °C im Klimaschrank durchgeführt. Durch die vorherrschenden Bedingungen zeigte sich kein negativer Einfluss auf die liposomale Größe und deren Verteilung für proliposomale Formulierungen bestehend aus wasserlöslichen Trägern. Unter Berücksichtigung des ZPs wurde die Stabilität der liposomalen Dispersion verbessert. Xylitol und Saccharose schienen die bestgeeignetsten Träger für stabile Formulierungen in Bezug auf eine vereinheitlichte Liposomengröße zu sein. Darüber hinaus war der PDI der beiden Formulierungen stabil und zeigte eine enge Größenverteilung. Das Zetapotential stieg auf einen Wert von ~ - 20 mV. Im Zuge der Formulierungsentwicklung wurden alternative pulverartige Trägermaterialien und unterschiedliche Lipid-Träger-Verhältnisse getestet. Letzteres stellte einen vielversprechenden Ansatz für die Herstellung kleiner Liposomen dar. Neben der Existenz von Proliposomen mit Hilfe von Polarisationsmikroskopie wurde auch die totale Anzahl an Vesikeln pro mm3 für unterschiedliche Lipide unter Verwendung einer Thoma-Zählkammer bestimmt. Je größer die Anzahl der gezählten Teilchen, umso kleiner die sich bildenden Liposomen. Unter Berücksichtigung der Anzahl wurden Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (18:0; DSPC) und Ei-Phosphatidylcholin (Ei-PC) als vielversprechende Lipide für ein Design of Experiment (DoE) ermittelt. Auf diesen Ergebnissen basierend, wurde eine Herstellung von PL im größeren Maßstab mit dem Glatt® Coater etabliert. Dabei stellte die Kombination der Lipide Ei-PC, 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (14:0; DMPG) und Cholesterol eine geeignete Fromulierung hinsichtlich der gewünschten Targets von Vesikelgröße, ZP und EE dar. Da die Phasenübergangstemperaturen der Lipide unterhalb von 23 °C liegen, konnte für spätere HPLC Versuche 37 °C als Freisetzungstemperatur gewählt werden. Weiterhin wurde ein proliposomales Granulat mit Tablettose® als Träger sowie den Wirkstoffen Ibuprofen und Fenofibrat hergestellt, dass eine erfolgreiche Weiterverarbeitung zu Tabletten ermöglichte. Auch nach Rekonstitution der Tabletten bildeten sich spontan Liposome. Für den Wirkstoff Fenofibrat wurde eine EE von nahezu 100 % ermittelt, was darauf schließen lässt, dass sich der Wirkstoff möglicherweise aufgrund seiner Lipophilie in die Lipidmembran eingelagert hat. Dies könnte auch in eine Vergrößerung der Liposomengröße resultieren. Desweiteren wurden Freisetzungsstudien mit Fenofibrat durchgeführt. Als Trägermaterial wurden Saccharose Träger (2 500 - 3 300 µm; GHP 5) verwendet. Die PL zeigten eine Initialfreisetzung mit Freigabe des Wirkstoffes innerhalb von drei Stunden. Es zeigte sich, dass der gesamte Wirkstoff in den MLVs solubilisiert war und keine Aggregation der Fenofibratmoleküle bei Kontakt mit Wasser stattfand. Im letzten Teil wurde eine Herstellungsmethode von Proliposomen mit Hilfe von Sprühtrocknung entwickelt. Zuerst wurde ein geeignetes Trägermaterial hergestellt, dass eine enge Korngrößenverteilung haben sollte, um das sich die Lipide schichten sollten. Der Einfluss von Zulufttemperatur (Tinlet) und Flussrate wurde untersucht, wobei sich eine Temperatur von 110 °C sowie eine Flussrate von 3 ml*min-1 etablierte. Die Ausbeute lag im Schnitt bei 75 % und einem d50-Wert von ~ 4 µm. Neben drei mikropartikulären Mannitolproben zur Herstellung von Proliposomen, wurde ebenfalls eine Probe mittels Sprühgefriertrocknungsverfahren hergestellt, die bei einem d50-Wert von ~ 12,5 µm lag. Es wurden vier Chargen an sprühgetrockneten Proliposomen hergestellt. Nach Rekonstitution mit bidestilliertem Wasser bildeten sich Liposomen, die mittels Polarisationsmikrokopie nachgewiesen wurden. Allerdings soll erwähnt werden, dass die totale Anzahl an Liposomen pro mm3 bei der Coating-Methode doppelt so hoch war. Desweiteren war erkennbar, dass die Vesikelgröße (d50-Werte zwischen 3 und 7 µm) von der Größe des sprühgetrockneten Trägermaterials abhängig war und nicht von der Größe der Proliposomen. Der poröse Charakter der sprühgefriergetrockneten Probe führte zu kleinen Liposomen. 10 % (m/m) Anteil an sprühgetrocknetem Mannitol lieferte das beste Ergebnis. Abschließend wurden beide Herstellungsmethoden im direkten Vergleich gegenübergestellt und Ansätze für mögliche Folgeversuche aufgezeigt. Im Hinblick auf die Entwicklung verschiedener proliposomaler Formulierungen mit schwer wasserlöslichen Wirkstoffen wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Herstellungsvarianten entwickelt: das Coating Verfahren und der Sprühtrocknungsprozess. Es ist gelungen lagerstabile Proliposomen herzustellen, die nach Zusatz von wässrigem Medium spontan Liposomen bildeten. Diese wurden unter anderem erfolgreich mittels Cryo-TEM hinsichtlich einer einheitlichen Größenverteilung und runden ULVs nachgewiesen. Desweiteren wurden die Liposomen hinsichtlich Größer, EE, ZP und Freisetzungsverhalten untersucht. Mittels eines DoE ist es gelungen, die Coating-Methode vom Labormaßstab in einen größeren Produktionsmaßstab erfolgreich zu transferieren. Daneben wurden granulatartige Proliposomen zu Tabletten verpresst, was einen vielversprechenden Ansatz zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit schwerlöslicher Stoffe darstellt