Novas perspectivas sobre os diferentes cenários ecoepidemiológicos da leishmaniose visceral canina no estado de São Paulo, Brasil: do diagnóstico à interação parasita-hospedeiro

Visceral leishmaniasis (VL), caused by the protozoan parasite Leishmania (Leishmania) infantum and transmitted to humans and reservoir hosts by female sandflies, represents a serious public health problem due to its continuous expansion to new areas and urban centers. In São Paulo (SP) state, Brazil, VL has a distinct temporal-geographic pattern dispersion, first appeared in the northwestern (NWSP) region, spreading in a southeastern (SESP) direction over time. The epidemiology and ecology of the disease in a particular region are determined by characteristics of the parasite, vertebrate hosts and invertebrate vectors species. Domestic dogs are widely considered to be the main reservoir of the parasite, that leads to the canine visceral leishmaniasis (CVL), which usually precedes human cases. The objectives of this doctoral thesis were to improve the cytopathological methods for direct diagnosis of CVL and to analyze the pathological and molecular fundamentals of host-parasite interactions from different eco-epidemiological scenarios in SP state, Brazil. In a first instance, we performed cytopathological methods as smear cytology (SC), liquidbased cytology (LBC), cell block (CB) and immunocytochemistry (ICC) in popliteal lymph nodes samples of dogs naturally infected with L. infantum to improve the CVL diagnosis. We showed that SC was the most accurate morphological diagnostic method (45.0%). Besides, LBC reduced the number of unsatisfactory cases (low sampled cell number), allowed excellent cellular preservation and the application of ancillary techniques, such as CB and ICC. CB-ICC alone or associated with SC demonstrated significantly higher sensitivity (70.00% and 72.00%, respectively) when compared to the SC alone (34.00%). CB-ICC showed to be more effective in the detection of infected animals with mild clinical signs and a promising tool to improve diagnosis of CVL and may be applied in routine epidemiological screening. Subsequently, lymph nodes samples of dogs naturally infected with L. infantum from NWSP and SESP of SP state were subject to a series of histopathology and immunohistochemistry (IHC) analysis to describe microscope lesions, parasite load, and cytokine profile. We evidenced differences between the two eco-epidemiologic scenarios of CVL in SP state. In SESP region, a marked subcapsular inflammatory infiltration and histiocytosis were noted in the popliteal lymph node tissues, while significantly higher parasite burden (p = 0.0004) and IHC scores of IL-1ββ (p = 0.0275) and IL-4 (0.0327) were observed in animals from NWSP area. A final study proposed the characterization of the parasite genotype in dogs naturally infected with L. infantum from SESP and NWSP areas. The deletion genotype of L. infatum on LinJ.31.2380 locus was predominantly identified in the SESP, with a frequency of 44.44%, while the non-deletion genotype was observed in 35.19% of the samples (p = 0.01945) from the NWSP area. Eight (14.81%) and three (5.56%) samples from NWSP demonstrated a third, mixed profile for the deleted site, representing heterozygosity equivalent and non-equivalent, respectively. This study showed no statistical difference among the specific genotype, the clinical status and the parasite load in the popliteal lymph node samples of the dogs. Differences in genetic profile of L. infantum population and in the host immune response associated with higher parasite burden in dogs can also contribute to explain the distinct eco-epidemiological patterns of VL in specific geographic regions of SP state, which requires the development of early/accurate diagnosis, better control and surveillance strategies to improve both public and animal health.A leishmaniose visceral (LV), causada pelo parasita protozoário Leishmania (Leishmania) infantum e transmitida para humanos e hospedeiros por fêmeas de flebotomíneos, representa um grave problema de saúde pública devido à sua contínua expansão para novas áreas e centros urbanos. No estado de São Paulo (SP), a VL apresenta um padrão de dispersão temporal e geográfica distinta, surgindo inicialmente na região noroeste (NWSP), e espalhando-se no sentido sudeste (SESP) ao longo do tempo. A epidemiologia e ecologia da doença em uma determinada região são determinadas pelas características das espécies parasitas, hospedeiros vertebrados e vetores invertebrados. Cães domésticos são amplamente considerados como o principal reservatório do parasita, que leva à leishmaniose visceral canina (LVC), a qual geralmente precede os casos humanos. Os objetivos desta tese de doutorado foram aprimorar as técnicas citopatológicas para o diagnóstico direto da LVC e analisar os fundamentos patológicos e moleculares das interações parasitohospedeiro advindos de diferentes cenários eco-epidemiológicos no Estado de São Paulo. Em um primeiro momento, realizamos exames citopatológicos como a citológica convencional (CC), a citologia de base líquida (CBL), o emblocado celular (EC) e a imunocitoquímica (ICC) em amostras de linfonodos poplíteos de cães naturalmente infectados com L. infantum para o aprimoramento diagnóstico da LVC. Nós demonstramos que CC foi o método diagnóstico morfológico mais preciso (45,0%). Além disso, a CBL reduziu o número de casos insatisfatórios (baixo número de células amostradas), permitiu excelente preservação celular e a aplicação de técnicas complementares, como EB e ICC. O EB-ICC sozinho ou associado ao CC demonstrou sensibilidade significativamente maior (70,00% e 72,00%, respectivamente) quando comparado ao CC isolado (34,00%). O EB-ICC mostrou-se mais eficaz na detecção de animais infectados com sinais clínicos leves e uma ferramenta promissora para melhorar o diagnóstico de LVC, podendo ser aplicado na triagem epidemiológica de rotina. Posteriormente, amostras de linfonodos de cães naturalmente infectados com L. infantum do NWSP e SESP do Estado de SP foram submetidos a uma série de análises histopatológicas e imuno-histoquímicas (IHQ) para descrever lesões microscópicas, carga parasitária e perfil de citocinas. Evidenciamos diferenças entre os dois cenários eco-epidemiológicos da CVL no Estado de SP. Na região SESP, um acentuado infiltrado inflamatório subcapsular e histiocitose foram notados nos tecidos dos linfonodos poplíteos, enquanto uma carga significativamente maior de parasitas (p = 0,0004) e dos escores IHC de IL-1ββ (p = 0,0275) e IL-4 (0,0327) foram observados em animais da área do NWSP. Um estudo final propôs a caracterização do genótipo do parasito em cães naturalmente infectados com L. infantum das áreas SESP e NWSP. O genótipo com deleção no loco LinJ.31.2380 de L. infatum foi predominantemente identificado no SESP, com uma frequência de 44,44%, enquanto o genótipo de não-deleção foi observado em 35,19% das amostras (p = 0,01945) da área da NWSP. Oito (14.81%) e três (5.56%) amostras do NWSP demonstraram um terceiro perfil misto para o sítio deletado, representando heterozigosidade equivalente e não equivalente, respectivamente. Este estudo não mostrou diferença estatística entre o genótipo específico, o estado clínico e a carga parasitária nas amostras de linfonodo poplíteo dos cães. Diferenças no perfil genético da população de L. infantum e na resposta imune do hospedeiro associada a maior carga parasitária em cães também podem contribuir para explicar os distintos padrões eco-epidemiológicos da LV em regiões geográficas específicas do Estado de SP, o que requer o desenvolvimento precoce diagnóstico preciso, melhor controle e estratégias de vigilância para aprimorar a saúde pública e animal