Targeting bile acid-activated receptors for preventing non-alcoholic fatty liver disease progression

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a range of liver lesions from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and remains a major cause of mortality when progressing to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Although risk factors relate with the metabolic syndrome, the biological mechanisms of disease are not entirely known. Therefore, a better understanding of NAFLD pathogenesis may help finding new treatments for patients with liver damage. In that regard, microRNAs (miRNAs or miRs) may act as putative therapeutic targets in NAFLD. In particular, miR-21 is increased in human NAFLD patients and its ablation in mice affords protective effects. In parallel, as key regulators of hepatic metabolism, bile acid-activated receptors (BAARs) also participate in NAFLD pathogenesis, supporting the use of its agonists in disease. To this end, it appears that ligands for BAAR farnesoid X receptor (FXR) and G protein-coupled receptor 5 (TGR5) are promising, although their efficacy is still limited by side effects. Of note, combining two or more agonists may offset these negative consequences. Altogether, we aimed to elucidate whether INT-767, a dual FXR and TGR5 agonist in pre-clinical, and/or miR-21 silencing could synergize in preventing NAFLD progression. Three-week old male C57BI/6J mice were fed a high fat choline deficient (HFCD) diet for 12 weeks, at which point they had their diets supplemented with INT-767 and/or were injected with antagomiR-21 up to 24 weeks of feeding. Animals fed the HFCD diet displayed progressive weight gains and serum ALT, AST and cholesterol increases. Histopathological analysis of the liver revealed increased lipid accumulation, paralleling increased gene and protein expression of several inflammatory, fibrotic and carcinogenic markers. Remarkably, either INT-767 supplementation or antagomiR-21 administration prevented most of these changes, with the conjugation of both putative therapeutic strategies showcasing better results. As no pharmacological treatment has proven to ameliorate NAFLD or to avoid its progression, the development of novel approaches that target several aspects of the metabolic syndrome simultaneously may ultimately embody novel, effective therapeutic strategies for NAFLD.O fígado gordo não alcoólico (FGNA) compreende um conjunto de lesões hepáticas desde a esteatose até à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), permanecendo uma grande causa de mortalidade ao evoluir para cirrose e carcinoma hepatocelular. Os seus fatores de risco relacionam-se com o síndrome metabólico, mas os mecanismos biológicos da doença não são ainda totalmente conhecidos. Nesse aspecto, foi já demosntrado que os microRNAs (miRNAs ou miRs) desempenham um papel funcional na patogénese do FGNA. Em particular, o miR-21 encontra-se aumentado em doentes com FGNA e a sua ablação em ratinhos protege contra o desenvolvimento da doença. Este efeito protetor é dependente, pelo menos em parte, da inibição do receptor nuclear (RN) receptor alfa ativado pelo proliferador peroxissoma (PPARα). De facto, os RNs e os receptores ativados por ácidos biliares (RAABs), sendo reguladores chave do metabolismo hepático, poderão participar na patogénese do FGNA, dando suporte ao uso dos seus agonistas no tratamento da doença. Nesse sentido, e apesar dos seus efeitos secundários, são promissores os ligandos para o receptor X dos farnesóides (FXR) e o receptor 5 acoplado a proteínas G (TGR5), uma vez que a sua combinação seletiva poderá reduzir esses efeitos negativos. Assim, torna-se importante avaliar se uma ativação seletiva e coordenada de diferentes RNs, se traduz em maiores benefícios, quando comparada com a utilização isolada de agonistas para um único recetor. Com este trabalho, o objetivo foi elucidar se o INT-767, um duplo agonista do FXR e TGR5 em estudos pré-clínicos e/ou o silenciamento do miR-21, e por conseguinte aumento da expressão do PPARα, poderiam demonstrar efeitos sinergéticos na prevenção da progressão do FGNA. Ratinhos C57BI/6J com 3 semanas foram alimentados com uma dieta rica em gorduras e deficiente em colina (HFCD), ou uma dieta controlo, durante 12 semanas. Após este período, os ratinhos demonstraram evidência de esteatose no fígado. Nesta altura, suplementou-se a dieta com o INT-767 e/ou injetaram-se os animais com um oligonucleótido inibidor do miR-21 (antagomiR-21), durante 12 semanas adicionais. Às 24 semanas sacrificaram-se os animais para análise histopatológica do fígado, assim como de diversos parâmetros metabólicos relevantes no âmbito desta patologia. Os resultados mostraram que os animais alimentados com a dieta HFCD aumentaram substancialmente de peso quando comparados com a dieta controlo. Este aumento foi substancialmente menor em animais cuja dieta foi suplementada com INT-767 e/ou aos quais foi administrado o antagomiR-21. Em paralelo, os níveis séricos das enzimas marcadoras de dano hepático alanina transaminase e aspartato transaminase, assim como do colesterol, aumentados nos ratinhos alimentados com a dieta HFCD, encontravam-se mais baixos em ratinhos recebendo o INT-767 e/ou o antagomiR-21. A análise histopatológica do fígado dos animais na dieta HFCD confirmou que estes continuaram a desenvolver FGNA desde as 14 semanas de alimentação, uma vez que a acumulação de lípidos no tecido era mais acentuada. Em paralelo, a expressão de citocinas pró-inflamatórias e genes pro-fibrogénicos também aumentou, em comparação com os animais na dieta controlo. Finalmente, a expressão proteica de genes envolvidos em processos de tumorigénese encontrava-se também aumentada. Quer o INT-767 quer o antagomiR-21 foram capazes de impedir a ativação de todas estas vias de sinalização patogénicas. Em particular, a administração combinada do INT-767 com o antagomir-21, a ratinhos na dieta HFCD, demonstrou ser mais eficaz na prevenção da progressão contínua da doença do que a sua utilização separada. Uma vez que atualmente não existe nenhum tratamento farmacológico cientificamente comprovado para o FGNA, ou para prevenir a sua progressão, o desenvolvimento de novas abordagens que tenham como alvo, em simultâneo, diferentes aspetos do síndrome metabólico, poderá dar origem a novas abordagens terapêuticas.The studies presented in this thesis were performed within the Cellular Function and Therapeutic Targeting research group, at the Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa, under the supervision of Rui E. Castro, PhD. and Cecília M. P. Rodrigues, PhD. This project has received funding support from European Structural and Investment Funds through the COMPETE Programme and from National Funds through Fundação para a Ciência e a Tecnologia (SAICTPAC/0019/2015). It was also supported in part by Intercept Pharmaceutical