Circulating microRNAs as Biomarkers for Breast Cancer Brain Metastasis

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018With the recent developments in the treatment of breast cancer (BC), that have improved prognosis of BC patients, metastatic disease is presently a major concern and the leading cause of death from BC. Particularly brain metastasis represent a serious oncologic problem, not only due to their high incidence in BC, poor prognosis and low survival but also because the brain microenvironment is considered a sanctuary for metastatic growth. While the blood brain barrier (BBB) restricts the entrance of most chemotherapeutics into the brain, brain cells can also contribute for tumor growth by exchanging factors with malignant cells. Altogether, this makes breast cancer brain metastases (BCBM) an uprising concern. Thus, the finding of reliable biomarkers that allow the early detection of BCBM, as well as new potential therapeutic targets, is in order. Recently, microRNAs (miRNAs or miR-) have arisen as powerful and specific biomarkers for different types of cancer and metastasis, having unique expression profiles depending not only on the type of cancer but also on the stage of the disease. Circulating miRNAs can be of special interest, due to their stability and easy quantification in biological fluids, allowing their usage in liquid biopsies for diagnosis and prognosis of oncologic diseases. Based on this, we hypothesized that miRNAs are aberrantly expressed in plasma prior to the detection of brain metastasis. So, the aim of this work was to identify miRNAs that could work as predictive biomarkers of BCBM in liquid biopsies. To this end, brain, lungs, kidneys, liver and plasma samples were collected from vehicle (control) and 4T1-injected female mice, at different timepoints during metastatic progression (5 hours, 3 days, 7 days and 10 days). Human samples of resected brain metastasis from triple negative BC patients were also studied. Analysis of brain and peripheral organs of the mouse model revealed that metastasis are particularly relevant in the brain, mainly in the hippocampus and that well established metastasis are only detectable from 7 days onwards. An initial miRNA screening by next generation sequencing (NGS) showed that plasma miRNAs are altered during brain metastasis development and that at 3 days, no metastasis were detected but a set of 8 miRNAs was deregulated. By real time PCR (RT-PCR), we could validate the downregulation of plasma miR-802-5p and miR-194-5p at three days and could see a trend for miR-92a-1-5p upregulation, and so, we propose that these miRNAs are potential biomarkers for the early detection of BCBM. Moreover, using bioinformatical tools, we predicted targets for these miRNAs, not only for a better understanding of the underlying mechanisms of these miRNAs but also to identify potential new targets for modulation. Matrix metalloproteinase-9 (MMP9) was a predicted target for miR-92a-1-5p. Immunofluorescence analysis of mouse brain sections revealed that MMP9 protein is expressed not only in malignant cells but also in the brain vasculature and in metastasis-associated vessels, pointing to a proangiogenic role of MMP9 Myocyte enhancer factor 2C (MEF2C) was predicted as a common target for both miR-802-5p and miR-194-5p. It was also observed that MEF2C is highly expressed in BCBM and that its expression increases with metastatic progression. Moreover, a nuclear translocation of MEF2C was observed in later stages of tumor progression, which indicates a higher activation of this transcription factor. Furthermore, MEF2C expression was detected in peritumoral astrocytes, pointing to a potential role of MEF2C in the cross-talk between astrocytes and malignant cells to promote tumor growth. High expression of MEF2C was further confirmed in human brain metastases from triple negative BC. In summary, this work revealed the potential in using circulating miRNAs as biomarkers for BCBM, pointing to miR-802-5p, miR-194-5p and miR-92a-1-5p as candidates to be used in liquid biopsies for the early detection of BCBM. It also revealed MEF2C as a new target for modulation and abrogation of BCBM.Com os desenvolvimentos recentes no tratamento do cancro da mama que têm vindo a melhorar o prognóstico dos doentes, o cancro metastático é uma preocupação e a principal causa de morte nos doentes de cancro da mama. Particularmente as metástases cerebrais, representam um problema na área da oncologia, não só devido à sua alta incidência no cancro da mama, mau prognóstico e baixa taxa de sobrevivência, mas também porque o microambiente do cérebro é bastante favorável ao desenvolvimento de metástases. Enquanto que a barreira hematoencefálica restringe a passagem da maioria dos medicamentos quimioterapêuticos, as células do cérebro também podem contribuir para o crescimento metastático através da troca de factores com as células malignas. Assim, as metástases cerebrais provenientes do cancro da mama são, cada vez mais, consideradas uma preocupação no tratamento do cancro e a descoberta de novos biomarcadores que permitam a sua detecção precoce e de novos alvos terapêuticos, é necessária. Recentemente, os microRNAs (miRNAs ou miR-) têm sido estudados como biomarcadores específicos para diferentes tipos de cancro e de metástases, tendo perfis de expressão únicos, dependendo não só do tipo de cancro, mas também do estadio da doença. Os miRNAs circulantes podem ter especial interesse para este efeito, devido à sua grande estabilidade e fácil quantificação em fluidos biológicos, que permite o seu uso em biópsias líquidas para o diagnóstico e prognóstico de doenças oncológicas. Sendo assim, neste trabalho, foi proposto que os miRNAs circulantes podem funcionar como biomarcadores eficientes para metástases cerebrais de cancro da mama, tendo como objectivo a selecção de miRNAs específicos que pudessem funcionar como biomarcardores precoces para este tipo de metástases. Para isto, inocularam-se ratinhos com células 4T1 ou com solução salina, como controlo e colheram-se os encéfalos, rins, pulmões e fígados e amostras de plasma a diferentes tempos depois da inoculação (3 dias, 7 dias e 10 dias). Também foram usadas amostravas humanas de metástases cerebrais de cancro da mama. A análise dos encéfalos e dos órgãos periféricos de ratinho demonstrou que este modelo metastiza fortemente para o encéfalo, ao contrário dos outros órgãos e que metástases bem estabelecidas só são detectáveis a partir dos 7 dias. Resultados de sequenciamento de nova geração mostraram os níveis expressão dos miRNAs no plasma estão alterados durante a formação e que aos 3 dias após a inoculação, apesar de ainda não serem detectáveis metástases, há um conjunto de 8 miRNAs que estão alterados no plasma. Por PCR em tempo real, foi possível validar a diminuição do miR-802-5p e do miR-194-5p aos 3 dias após inoculação, relativamente ao controlo. Foi também observada uma tendência do miR-92a-1-5p para estar aumentado. Assim, propõe-se estes três miRNAs como potenciais candidatos a biomarcadores precoces para a detecção de metástases cerebrais de cancro da mama. Através do uso de ferramentas bioinformáticas, foi feita uma previsão de possíveis alvos para estes miRNAs, não só para se ter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes dos miRNAs, mas também como um processo de triagem para selecionar novos alvos para modulação em metástases cerebrais. A metaloproteinase da matriz-9 (MMP9) foi um dos alvos previstos para o miR-92a-1-5p. Análise por imunofluorescência em secções de encéfalo de ratinho, revelou que a MMP9 é expressa, não só em células malignas no encéfalo, mas também na vasculatura cerebral e em vasos associados às metástases, apontando para um papel pro-angiogénico da MMP9. Por sua vez, o factor potenciador de miócitos 2C (MEF2C) foi previsto como alvo comum para o miR-802-5p e para o miR-194-5p. Através de análise por imunofluorescência, também em secções de encéfalo de ratinho, mostrou-se pela primeira vez que o MEF2C tem uma expressão elevada em metástases cerebrais de cancro da mama e que a sua expressão aumenta com a progressão das metástases. Foi também observada uma translocação nuclear do MEF2C em fases mais avançadas do tumor, o que pode indicar uma maior activação deste factor de transcrição. Além disso, a expressão do MEF2C foi também detectada, especificamente em astrócitos peritumorais, apontando para um papel do MEF2C na interacção entre as células malignas e os astrócitos, para potenciar o crescimento tumoral. A expressão elevada do MEF2C foi também confirmada em metástases cerebrais humanas provenientes de cancro da mama triplo negativo. Em suma, este trabalho demonstrou o potencial do uso dos miRNAs circulantes como biomarcadores para metástases cerebrais de cancro da mama, apontando o miR-802-5p, o miR-194-5p e o miR-92a-1-5p como candidatos para serem usados nas biópsias líquidas para a detecção precoce deste tipo de metástases. Revelou também o potencial do uso do MEF2C como um novo alvo para modulação em metástases cerebrais de cancro da mama.The studies presented on this master thesis were performed in the research group “Neuron Glia Biology in Health & Disease”, from Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa, under the supervision of Maria Alexandra Brito, Ph.D. and Mafalda Videira, Ph.D. A part of the work was performed in the research group “Physiology and Pathology of the Blood-Brain Barrier” Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Hungary, during three scientific mission of the student to Hungary. This study was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT – UID/DTP/04138/2013 and PTDC/MED-ONC/29402/2017), Portugal, and by National Research, Development and Innovation/Hungarian Scientific Research Fund (NKFIH/OTKA – K-100807 and K-116158), Hungary