Expression profiling of rust resistance-related genes in coffee and development of a virus induced gene silencing (VIGS)-based tool for functional analysis

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é a doença mais importante do cafeeiro-Arábica, afetando praticamente todas as regiões do mundo onde se produz café. O controlo desta ferrugem pode ser conseguido recorrendo à luta química, nomeadamente através da aplicação de fungicidas cúpricos, como medida preventiva. No entanto, este meio de combate é desvantajoso tanto a nível económico como ambiental, além de que a sua aplicação nem sempre é rentável. Uma medida mais eficaz no combate a esta doença é a utilização de plantas de variedades resistentes à ferrugem. Embora o melhoramento genético do cafeeiro por métodos convencionais para o aumento desta resistência tenha tido muito sucesso, a sua durabilidade é constantemente desafiada pela alta adaptabilidade do fungo. Um melhor entendimento dos mecanismos moleculares de resistência do cafeeiro ao fungo é crucial para aumentar a eficácia das medidas de controlo da doença e prolongar o tempo de vida de cultivares comerciais resistentes. Estudos anteriores de proteómica e de expressão de genes identificaram diversas proteínas/genes putativamente envolvidos em vias de sinalização, reconhecimento e processos de defesa, associados à resposta das plantas de cafeeiro à infeção pelo fungo. O objetivo deste trabalho foi investigar os perfis de expressão de genes putativamente envolvidos na resistência do cafeeiro a H. vastatrix e desenvolver uma ferramenta baseada na técnica virus induced gene silencing (VIGS) para posteriormente elucidar à cerca das funções de genes candidatos. Numa primeira parte do trabalho, plantas Coffea arabica (variedade Caturra) foram inoculadas com o isolado 71 (raça VI) de H. vastatrix, formando uma interação incompatível, e com o isolado 1427 (raça II) formando uma interação compatível. Posteriormente, foram colhidas folhas inoculadas 24, 48, 72 e 96 horas após inoculação (hpi). Para um estudo comparativo, foram também colhidas folhas controlo em cada tempo, as quais não sofreram qualquer tipo de tratamento. Com o intuito de monitorizar a evolução da doença e validar os tempos de infeção selecionados, foram feitas análises citológicas para observar os diferentes tipos de estruturas e respetiva abundância que se desenvolvem ao longo do processo de infeção, comparando entre interações compatíveis e incompatíveis. Em relação às fases de pré-penetração (24 hpi), não existe diferença significativa entre os dois tipos de interação, sendo que em ambas as respostas se observaram a germinação dos uredósporos e posterior diferenciação de apressórios. Na fase de pós- penetração, em ambos os tipos de interações existe o desenvolvimento das estruturas de infeção do fungo. No entanto, na interação incompatível, H. vastatrix cessou o seu crescimento mais frequentemente na fase de apressório, chegando a formar células mãe do haustório (CMH) com haustórios numa baixa percentagem de zonas de infeção (2% às 96 hpi), não progredindo para além deste ponto. Pelo contrário, na interação compatível, o crescimento do fungo prosseguiu sem aparente inibição com a formação de CMH com haustório a partir das 48 hpi, atingindo maior percentagem de zonas de infeção às 96 hpi e acabando por colonizar os tecidos foliares. Para as interações cafeeiro-ferrugem em estudo, foram analisados os perfis de expressão de sete genes putativamente envolvidos em mecanismos de reconhecimento, sinalização e defesa (GL18058, GL22853, Asp23673, Asp203, PR1, PR10 e RLK), através de PCR quantitativo em tempo real. Os genes GADPH e Ubiquitina foram usados como genes de referência. Os genes GL18058 e Asp203 aparentemente não apresentam níveis de expressão significativos em nenhuma das interações nos tempos de infeção estudados, à exceção do gene Asp203 na interação compatível que tem um pico de ativação às 72 hpi. De notar que no gene GL18058 existe um perfil contrastante entre as duas interações às 24 hpi, e também uma alteração no perfil de expressão na interação incompatível, entre as 24 e as 48 hpi, sendo assim interessante estudar tempos intermédios deste intervalo em futuros trabalhos. Os genes GL22853 e Asp23673 mostraram estar reprimidos em todos os tempos de infeção estudados, com exceção das 96 hpi no gene Asp23673 que apresenta uma baixa expressão. Para estes dois genes, e apesar de não haver diferenças significativas na sua expressão comparando as duas interações, detetou-se diferença estatística entre alguns dos tempos estudados em ambas as interações. Por sua vez, o gene PR1 tem um pico de ativação às 24 hpi na interação incompatível, sendo que nos restantes tempos está pouco ativo, sugerindo que a sua expressão poderá estar envolvida no bloqueio do desenvolvimento do fungo. Por outro lado, os genes PR10 e RLK têm o seu maior pico de expressão às 48 hpi. Na interação compatível, nestes 3 genes, existe um pico de expressão às 72 hpi, correspondendo possivelmente a uma resposta à infeção, no entanto demasiado tardia para impedir o crescimento do fungo. Para nenhum dos genes analisados existe uma diferença estatisticamente relevante nos perfis de expressão, entre os dois tipos de interação. Hipoteticamente, os genes pouco ativos ou mesmo reprimidos podem ter tido um maior envolvimento no processo de infeção numa fase mais precoce, correspondendo a tempos que não foram estudados neste trabalho, ou podem ter sido alvo de uma regulação negativa para tentar inibir o desenvolvimento do fungo. Nos restantes genes que estão putativamente associados a processos de reconhecimento e defesa da planta, observa-se uma tendência para um aumento da expressão nos dois tipos de interação, sendo que na interação incompatível esse aumento dá-se numa fase anterior do processo de infeção. O mesmo tipo de resposta numa fase mais tardia da infeção poderá não ser eficaz para bloquear o crescimento do fungo resultando numa interação compatível, o que é consistente com as análises citológicas. A transformação genética representa outra abordagem para caracterização funcional de genes candidatos que, apesar de muito eficiente nalgumas espécies é muitas vezes difícil de aplicar a grande parte das espécies de plantas lenhosas, incluindo o cafeeiro. Neste trabalho, procurou-se desenvolver uma metodologia eficaz, com base na tecnologia recombinante de vetores virais para o silenciamento de genes candidatos denominada VIGS, que leva à perda de função de proteínas alvo. Esta abordagem explora mecanismos de silenciamento pós transcricional (PTGS-post-transcriptional gene silencing) utilizados pelas plantas como defesa contra vírus invasores. Esta estratégia tem sido muito usada nos últimos anos, em várias plantas, para estudar a função de genes de interesse. O vetor viral é construído por inserção no genoma viral de um fragmento do gene a silenciar no hospedeiro que, neste caso, consiste num vetor derivado do Tobacco rattle virus (TRV), um vírus bipartido com dois genomas TRV1 e TRV2. Posteriormente, procede-se à transferência desta construção para a planta através de Agrobacterium tumefaciens. Assim é possível redirecionar o mecanismo de defesa mediado por RNA do hospedeiro para o silenciamento ou repressão da expressão do gene de interesse na planta, afetando a função da proteína correspondente. Neste trabalho, foi construído um vetor TRV2::PDS (Phytoene desaturase), utilizado como controlo positivo por ter um fragmento do gene repórter PDS, o qual foi transferido para cafeeiros e plantas de tabaco utilizadas como controlo positivo, através de A. tumefaciens por três métodos de inoculação distintos: agroinoculação, agrodrench e imersão das raízes das plantas na suspensão de bactérias contendo a construção. Foram testados diversos fatores que estão descritos como influenciadores da eficácia do sistema de silenciamento do gene PDS, tais como o estádio de desenvolvimento da planta, OD600 da suspensão bacteriana e temperatura pós inoculação. Após testadas as diversas condições, nenhum dos indivíduos, tanto de tabaco como cafeeiro, evidenciou cloroses nas folhas emergentes, que seria o fenótipo esperado após aplicação do sistema VIGS, em consequência do silenciamento do gene PDS. No entanto, foi possível detetar a presença do vetor viral no genoma de plantas inoculadas, mostrando que embora a integração do vetor pareça ter ocorrido, mesmo que de uma forma transiente ou pouco eficiente, por alguma razão não se verificou a repressão do gene PDS, ou alternativamente, a diminuição da expressão do gene não foi suficiente para mostrar o fenótipo esperado. Estes resultados confirmaram trabalhos anteriores e identificaram genes de interesse para analises funcionais futuras. Estudos adicionais são necessários para o desenvolvimento de um sistema VIGS otimizado em cafeeiro, o que seria uma ferramenta muito útil para a caracterização funcional de genes putativamente envolvidos na resistência da planta ao fungo. Após validação da função dos genes candidatos e confirmação do envolvimento na resistência à ferrugem, este conhecimento seria importante para desenvolver marcadores moleculares que permitissem selecionar variedades resistentes de forma expedita.Coffee leaf rust is a disease caused by the fungus Hemileia vastatrix that leads to big losses in coffee production. Management strategies used to combat the disease are not ideal or completely effective and therefore, increasing the knowledge on the molecular mechanisms involved in coffee-pathogen interactions is a key approach to support breeding programs for increased resistance. This work aimed to investigate the expression profiles of candidate genes for coffee resistance in compatible and incompatible interactions with H. vastatrix, and to develop a virus induced gene silencing (VIGS) system to further validate and elucidate the function of selected candidate genes. In the first part of this work, key-time points of the infection process of compatible and incompatible interactions between Coffea arabica (var. Caturra) and H. vastatrix were monitored by cytological observations to validate the time-course for subsequent gene expression analysis. Gene expression profiles of seven candidate genes (GL18058, GL22853, Asp23673, Asp203, PR1, PR10 and RLK) putatively involved in signaling, recognition and defense pathways were analyzed by qPCR. Genes GL18058 and Asp203 seem to have no significant expression in the time-points selected. Genes GL22853 and Asp23673 are repressed throughout most of the infection time course, showing significant expression differences between different time-points, but no differential expression between compatible and incompatible interactions. In contrast, RLK, PR1 and PR10 genes revealed different expression profiles between the susceptibility and resistant coffee plant responses. These genes were up-regulated in an earlier time point in the incompatible interaction, and later on, although in a lower magnitude, in the compatible interaction. This could be related with defense responses resulting in the restricted fungal development in the incompatible interaction, while in the compatible interaction there is a delay in response and the infection progress is not affected. In addition, a putative correlation between the expression profiles of Asp23673 and PR genes could support the possible involvement of Asp23673 in degrading overaccumulated pathogenesis-related proteins (PR). For the establishment of a VIGS system, a tobacco rattle virus (TRV) derived vector with an insert of the PDS gene was constructed and delivered to coffee plants by Agrobacterium tumefaciens. The same procedure was done for tobacco plants, as a control system. However, silencing of PDS using the developed VIGS system on both coffee and tobacco was unsuccessful, independently of the different experimental conditions tested, including different preparation of bacteria cultures, methods of inoculation and plant developmental stages. Overall, our results confirmed previous studies and provided molecular insights on coffee-H. vastatrix interactions, and identified genes-of-interest for further functional studies. Additional studies are needed to develop and optimize a VIGS system in coffee plants, which would be a useful tool for better understanding the role of candidate resistance genes and contribute to improve the selection of coffee resistance to H. vastatrix, with the development of molecular markers